[发明专利]柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建及接种方法在审
| 申请号： | 201810367772.7 | 申请日： | 2018-04-23 |
| 公开（公告）号： | CN108531502A | 公开（公告）日： | 2018-09-14 |
| 发明（设计）人： | 宋震;崔甜甜;宾羽;晏建红;李中安;周常勇 | 申请（专利权）人： | 西南大学 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N15/82;C12N15/40;A01G7/06;C12R1/94 |
| 代理公司： | 重庆市前沿专利事务所(普通合伙) 50211 | 代理人： | 邹晓艳 |
| 地址： | 400715*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建方法，步骤：(1)三个覆盖CTV基因组全长特异片段CTV1、CTV2、CTV3的长链RT‑PCR扩增；(2)三元穿梭载体pCY线性化；(3)TAR克隆：采用醋酸锂转化法将CTV1、CTV2、CTV3回收片段和线性化的三元穿梭载体pCY共转化酵母菌YPH501；(4)转化农杆菌；(5)农杆菌介导接种，从而鉴定获得CTV侵染性克隆。还公开了侵染性克隆的接种方法：(1)播种：柑桔种子剥去外种皮播于培养基，暗培养；2)离心收集携带CTV侵染性克隆与Hc‑Pro或P19表达质粒的农杆菌细胞，用接种缓冲液悬浮；(3)真空浸润；(4)暗培养。 | ||
| 搜索关键词： | 侵染性克隆 接种 柑桔衰退病毒 穿梭载体 暗培养 线性化 构建 酵母菌 醋酸锂转化法 农杆菌介导 农杆菌细胞 表达质粒 柑桔种子 离心收集 特异片段 真空浸润 培养基 共转化 缓冲液 基因组 农杆菌 外种皮 长链 悬浮 播种 克隆 回收 携带 覆盖 转化 | ||
【主权项】：
1.一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)CTV基因组全长cDNA的长链RT‑PCR扩增：提取感染CTV的植株总RNA，合成其基因组全长cDNA第一链，进而使用三对特异引物CTV1F、CTV1R，CTV2F、CTV2R与CTV3F、CTV3R分别进行PCR扩增，得到覆盖CTV基因组全长的三个特异片段CTV1、CTV2、CTV3；所述引物CTV1F、CTV1R、CTV2F、CTV2R与CTV3F、CTV3R的序列分别如SEQ ID NO:3～8所示；(2)三元穿梭载体pCY线性化：采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切如SEQ ID NO:17所示的三元穿梭载体pCY，得到pCY线性化的载体；(3)TAR克隆：采用醋酸锂转化法将CTV1、CTV2、CTV3回收片段和线性化的三元穿梭载体pCY共转化酵母菌YPH501，在酵母细胞内通过同源重组完成CTV基因组全长cDNA克隆的构建；(4)转化农杆菌：提取步骤(3)所获酵母重组质粒，通过电击转入C58C1或GV3101农杆菌感受态细胞；(5)农杆菌介导接种：接种柑桔或本生烟幼苗，从而鉴定获得CTV侵染性克隆。
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