[发明专利]柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建及接种方法

说明书

本发明公开了一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建方法，步骤：(1)三个覆盖CTV基因组全长特异片段CTV1、CTV2、CTV3的长链RT‑PCR扩增；(2)三元穿梭载体pCY线性化；(3)TAR克隆：采用醋酸锂转化法将CTV1、CTV2、CTV3回收片段和线性化的三元穿梭载体pCY共转化酵母菌YPH501；(4)转化农杆菌；(5)农杆菌介导接种，从而鉴定获得CTV侵染性克隆。还公开了侵染性克隆的接种方法：(1)播种：柑桔种子剥去外种皮播于培养基，暗培养；2)离心收集携带CTV侵染性克隆与Hc‑Pro或P19表达质粒的农杆菌细胞，用接种缓冲液悬浮；(3)真空浸润；(4)暗培养。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建及接种方法。

背景技术

柑桔衰退病毒(Citrus tristezavirus,CTV)是对世界柑桔生产具有严重危害的一种病原物。目前世界柑桔产量第二的巴西，曾一度因CTV为害而使其柑桔业濒临崩溃。迄今为止，CTV毁灭的柑桔树达1亿株以上，并且依然威胁着世界上以酸橙为砧木的柑桔和对CTV茎陷点型株系敏感的葡萄柚、柚和某些甜橙等品种(系)的生产。在我国，CTV分布较为普遍，初步鉴定表明株系分布亦很广泛。但由于我国宽皮柑桔和甜橙生产上常用的砧木枳、酸桔、红桔、红黎檬、枸头橙等多抗病或耐病而未造成严重为害。个别地区如云南宾川、建水等由于使用了感病的香橼作砧木而导致柑桔植株大量死亡。CTV能够侵染柑桔属绝大多数种、栽培种和杂交种，还可侵染柑桔属一些近缘属植物。CTV可以通过包含韧皮部的组织嫁接传播，在田间由桔蚜、棉蚜、桔二叉蚜和绣线菊蚜等蚜虫以非循环半持久方式进行传播。此外，CTV还可以通过菟丝子传播。在人工接种条件下CTV可侵染本生烟。

CTV是甲型长线形病毒科，长线形病毒属的一种正义单链单分体RNA病毒，是目前已知最大的植物病毒(Karasev et al.，1995)。其基因组为19226-19296nt的正义单链RNA，包装于2000×11nm的螺旋对称的线形病毒粒体当中，螺距3.5-3.7nm，每圈螺旋由8.5-10个外壳蛋白亚基构成。对T385序列分析表明，CTV基因组包含12个开放读码框(ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF11)以及5’非转译区(5’UTR)、3’非转译区(3’UTR)。

侵染性克隆不仅为病毒研究提供背景单一而可靠的遗传材料，还可用于研究病毒的移动、复制及其致病机理，同时还为深入研究病毒与寄主互作机制、进行病毒载体化改造和应用奠定坚实的基础。然而，病毒全长cDNA侵染性克隆的构建技术性较强，构建工作难度大。由于CTV是最大的植物病毒，目前为止，仅有一个T36型CTV分离株获得了侵染性克隆，该克隆采用传统的酶切连接法构建，费时费力且成功率极低。同时，该克隆必须首先接种本生烟，2个月左右后提取病毒粒子才能够接种和侵染柑桔，侵染周期长，侵染率较低，也限制了该克隆的应用。此外，有研究表明，利用大肠杆菌构建较大基因组RNA病毒全长cDNA克隆时，由于其自身编码的病毒蛋白可能会对宿主菌产生毒性作用，从而导致非特异性重组，出现不稳定现象。这成为病毒侵染性克隆构建面临的最大困难和挑战。病毒全长基因组克隆在E.coli中存在的不稳定现象的机制仍不清楚。通常利用以下几个方法解决：将病毒序列分段克隆，侵染前再短暂的连接；或利用拷贝数目较低的载体；或是调控细菌生长的环境(如降低培养温度等)来减少毒性；也有利用插入内含子到病毒全基因组序列中来避免产生具有毒性的蛋白。但这些方法均耗时耗力且成功率低。在前期的尝试中，利用大肠杆菌作宿主绝大多数CTV分离株都未能获得侵染性克隆，猜测可能与前述不稳定性有关。