[发明专利]柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建及接种方法

权利要求书

1.一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)CTV基因组全长cDNA的长链RT-PCR扩增：提取感染CTV的植株总RNA，合成其基因组全长cDNA第一链，进而使用三对特异引物CTV1F、CTV1R，CTV2F、CTV2R与CTV3F、CTV3R分别进行PCR扩增，得到覆盖CTV基因组全长的三个特异片段CTV1、CTV2、CTV3；所述引物CTV1F、CTV1R、CTV2F、CTV2R与CTV3F、CTV3R的序列分别如SEQ ID NO:3～8所示；

(2)三元穿梭载体pCY线性化：采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切如SEQ ID NO:17所示的三元穿梭载体pCY，得到pCY线性化的载体；

(3)TAR克隆：采用醋酸锂转化法将CTV1、CTV2、CTV3回收片段和线性化的三元穿梭载体pCY共转化酵母菌YPH501，在酵母细胞内通过同源重组完成CTV基因组全长cDNA克隆的构建；

(4)转化农杆菌：提取步骤(3)所获酵母重组质粒，通过电击转入C58C1或GV3101农杆菌感受态细胞；

(5)农杆菌介导接种：接种柑桔或本生烟幼苗，从而鉴定获得CTV侵染性克隆。

2.如权利要求1所述的柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的三元穿梭载体pCY的构建方法为：

A、采用限制性内切酶Sac II单酶切双元表达载体质粒DK1317-2，得到线性化的载体；

B、以pYES1L Vector为模板，如SEQ ID NO:1～2所示的PYES2117F、PYES2117R为引物扩增，然后回收目的片段；

C、将线性化DK1317-2载体和步骤B得到的回收片段进行重组构建，转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，即得。

3.如权利要求1所述的柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)农杆菌介导接种的方法为真空浸润法接种，或者通过农杆菌注射接种4-6叶期的本生烟后再提取CTV病毒粒子接种柑桔。

4.一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的接种方法，其特征在于，采用农杆菌介导的真空浸润法，具体包括如下步骤：

(1)播种：柑桔种子剥去外种皮，播于培养基上暗培养5-10天；

(2)CTV接种缓冲液准备：分别离心收集携带CTV侵染性克隆与Hc-Pro或P19表达质粒的农杆菌细胞，用接种缓冲液悬浮，使其OD₆₀₀分别为0.8～1.2和0.2～0.5；

(3)真空浸润：将步骤(1)所获幼苗浸入步骤(2)的缓冲液，在真空下保持20～40秒并迅速释放；

(4)暗培养：接种后置于培养箱暗培养5～7天，转入自然条件下培养。

5.如权利要求4所述的柑桔衰退病毒侵染性克隆的接种方法，其特征在于，所述步骤(2)中携带CTV侵染性克隆质粒的农杆菌细胞是通过权利要求1中步骤(1)至(4)得到的。

6.如权利要求4所述的柑桔衰退病毒侵染性克隆的接种方法，其特征在于，所述步骤(2)中用于悬浮农杆菌细胞的缓冲液中包含10mmol·L^-1MgCl₂，10mmol·L^-1MES，200μmol·L^-1AS。