[发明专利]一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法

摘要

本发明提供一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法，通过制备活化的人PBMCs，NOD/SCID小鼠造模，小鼠人白细胞数量含量植入检测，小鼠GVHD靶器官的病理表现建立。本发明通过应用环磷酰胺药物联合抗小鼠CD122单克隆抗体预处理代替亚致死剂量辐照方法建立一种人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型。该模型具有模拟临床上化疗预处理的异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病的特点；建模型效率高，重复性好；造模过程简单易行；弥补了国内很多研究中心缺乏辐照相关的仪器设备而不能进行相关研究的缺陷，能为在活体动物内进行人类免疫系统GVHD研究提供实验平台。

主权项

一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法，通过以下步骤实现： （1）活化的人PBMCs制备：取正常志愿者外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640重悬细胞至细胞终密度为2×106/ml，加入PHA和白介素‑2共培养7天； （2）NOD/SCID小鼠造模：实验前1周取6周龄无特定病原体级NOD/SCID雄性小鼠，饲养于SPF级层流柜中，饲料及饮用水均经无菌处理，并在饮用水中加入庆大霉素32×104U/L和红霉素250mg/L，小鼠输入活化的人PBMCs当天作为第0天，第0天前面的时间均以“‑”表示，于‑3至‑1天进行环磷酰胺联合抗小鼠CD122单克隆抗体预处理，预处理后小鼠分为两组，每组6只，一组为实验组，一组为对照组，实验组小鼠中每只输入制备好的活化人PBMCs，对照组小鼠输入磷酸盐缓冲液，之后每天定期观察小鼠体重、腹泻、皮肤GVHD表现、活动情况；（3）小鼠人白细胞数量含量植入检测：于第10天取小鼠血50μl，小鼠血进行抗人CD45 FITC标记，流式细胞术检测人CD45阳性白细胞数量含量；取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，进行抗人CD45 FITC标记，流式细胞术检测人CD45阳性白细胞含量；（4）小鼠GVHD靶器官的病理表现：待小鼠自然死亡后，取小鼠的肝脏、小肠和肾脏等各个器官进行常规石蜡包埋、切片，常规苏木素‑伊红染色，查看各脏器中GVHD病理表现，并用抗人CD45单克隆抗体对各脏器进行免疫组化检测，查看人淋巴细胞在各脏器中的浸润情况。