[发明专利]一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法。建立具有模拟临床异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病特点的疾病模型，可为研究移植物抗宿主病的发生机制和诊疗方法提供研究平台。

背景技术

移植物抗宿主病（GVHD）是异基因造血干细胞移植后的主要并发症和死亡原因，成为阻碍移植成功的关键因素。降低或减轻GVHD的发生及程度相关的体外、动物模型和临床研究显得尤为迫切。目前大部分GVHD动物模型建立在不同H-2抗原不合的小鼠间移植，与人类造血干细胞移植后发生的GVHD存在一定的差异。近年来人源化免疫系统NOD/SCID小鼠的出现为在活体内进行人类免疫功能研究提供了可能。人源化免疫系统NOD/SCID小鼠是指在小鼠体内建立人的免疫系统，该小鼠能够提供研究人免疫系统的体内实验平台，对研究开发疫苗、药物试验、肿瘤防治和移植排斥反应等方面具有重要意义。人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型为GVHD研究提供了很好的疾病模型，经典的该模型建立过程中首先需要对NOD/SCID小鼠进行亚致死剂量辐照预处理，接着输注一定数量的人外周血单个核细胞（PBMCs）。亚致死剂量的辐照能够抑制宿主的固有免疫，同时增加植入细胞所需要的龛位，所以亚致死剂量辐照是人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型成功建立的关键，但是国内很多研究中心缺乏辐照相关的仪器设备从而限制了该模型的广泛应用。为此，本发明中我们应用环磷酰胺药物联合抗小鼠CD122单克隆抗体预处理代替亚致死剂量辐照并回输在体外预先用植物血凝素（PHA）活化的人PBMCs的方法建立了人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型，为国内大多数研究中心能够开展该模型相关研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法，通过以下步骤实现： 

（1）活化的人PBMCs制备：取正常志愿者外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640重悬细胞至细胞终密度为2×10⁶/ml，加入PHA和白介素-2（IL-2）共培养7天后准备小鼠输入用。

（2）NOD/SCID小鼠造模：实验前1周从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买6周龄无特定病原体（SPF）级NOD/SCID雄性小鼠，饲养于SPF级层流柜中，饲料及饮用水均经无菌处理，并在饮用水中加入庆大霉素（32×10⁴U/L）和红霉素（250mg/L）。小鼠输入活化的人PBMCs当天作为第0天，第0天前面的时间均以“-”表示。于-3至-1天进行环磷酰胺联合抗小鼠CD122单克隆抗体预处理，预处理后小鼠分为两组，每组6只，一组为实验组，一组为对照组。实验组小鼠中每只输入制备好的活化人PBMCs，对照组小鼠输入磷酸盐缓冲液。之后每天定期观察小鼠体重、腹泻、皮肤GVHD表现（毛发脱落、红斑等）、活动情况等。

（3）小鼠人白细胞数量含量植入检测：于第10天取小鼠血50μl，小鼠血进行抗人CD45 FITC标记，流式细胞术检测人CD45阳性白细胞数量含量；取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，进行抗人CD45 FITC标记，流式细胞术检测人CD45阳性白细胞含量。

（4）小鼠GVHD靶器官的病理表现：待小鼠自然死亡后，取小鼠的肝脏、小肠和肾脏等各个器官进行常规石蜡包埋、切片，常规苏木素-伊红（HE）染色，查看各脏器中GVHD病理表现，并用抗人CD45单克隆抗体对各脏器进行免疫组化检测，查看人淋巴细胞在各脏器中的浸润情况。

本发明通过应用环磷酰胺药物联合抗小鼠CD122单克隆抗体预处理代替亚致死剂量辐照方法建立一种人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型。其具有如下特点：（1）该模型具有模拟临床上化疗预处理的异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病的特点；（2）建模型效率高，重复性好；（3）造模过程简单易行；（4）弥补了国内很多研究中心缺乏辐照相关的仪器设备而不能进行相关研究的缺陷，能为在活体动物内进行人类免疫系统GVHD研究提供实验平台。

附图说明

图1是对照组小鼠和实验组小鼠中分离的外周血细胞、脾细胞和骨髓细胞的流式分析图。

图2是对照组和实验组小鼠处死后分离的肝脏、小肠和肾脏的病理活检HE染色图。

图3是对照组和实验组小鼠肝脏、小肠和肾脏组织的抗人CD45单克隆抗体免疫组化图。

具体实施方式