[发明专利]一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA

说明书

本发明公开了一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA。采用同源置换的原理，构建了香蕉枯萎菌Δdcl1、Δdcl2和Δdcl1/2基因缺失突变体，并进行了非生物胁迫测试和致病力分析，结果显示经过荧光增白剂CFW处理后，Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体更加敏感，生长受到抑制，MgCl₂处理后，Δdcl1突变体、Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体的生长均受到抑制。Δdcl1突变体致病力增强，Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体致病力减弱；此外，结合小RNA深度测序获得各突变体小RNA，为进一步解析香蕉枯萎病的致病机制，开发RNA来源的防控措施等提供理论和技术支撑。

技术领域

本发明涉及一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA，属于生物工程技术领域。

背景技术

小RNA，包括miRNA和siRNA，是一类21-24nt长度的小分子非编码RNA，通过剪切靶标mRNA或转录抑制的方式导致序列特异性的转录后基因沉默调控，均由类似RNase III的核酸内切酶Dicer(或Dicer类似蛋白)加工产生。Dicer(DCL)作为一种特异性核糖核酸内切酶参与了小RNA生物合成途径，Dicer的作用机制分两步：第一步，Dicer与dsRNA结合形成酶-dsRNA复合体，在ATP的作用下将dsRNA解螺旋并将其切割产生5'端磷酸基、3'端羟基且含有2nt核苷酸突出的21-24nt小片段siRNAs；第二步，小片段的siRNA与含有PAZ功能域的Argonaute(AGO)蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)，该复合体具有序列特异性的核酸内切酶活性，能够特异性的降解与siRNA同源的靶标mRNA。

真菌也能编码与植物的miRNA类似的miRNA，命名为microRNA类似小RNAs(microRNA-like RNAs，milRNAs)。milRNAs的生物合成途径与植物和动物的miRNA生物途径有很大的差异，粗糙脉孢菌(N.crassa)中发现的milRNAs长度一般是19-25nt，具有发夹卡结构，形成的milRNAs具有5'末端U的偏好性，能够特异与Argonaute(AGO)蛋白结合发挥功能。粗糙脉孢菌中有四条不同的milRNAs生物形成途径，这些milRNAs通过Dicers、QDE-2、核酸外切酶活性的QIP效应蛋白以及具有RNaseⅢ功能域的线粒体核糖体大亚基MRPL3蛋白(mitochondrial ribosomal protein large subunit,MRPL3)的不同组合而产生，其中包括一条不依赖Dicer的milRNA产生途径(disiRNAs)(Lee et al.,2010)。虽然四种途径中从基因间隔区转录的RNA前体序列长度各异，但都与大多数的植物和动物的miRNA依赖RNAPolymerase II转录不同，粗糙脉孢菌的milRNA主要依赖Pol III转录的(Yang et al.,2013)。milR-1是粗糙脉孢菌中丰度最高的miRNA-like RNAs，Xue et al.(2012)以milR-1为研究对象构建了依赖AGO的milR-1离体生物形成的生物化学研究框架，研究表明milR-1的加工成熟过程可以分为5个步骤，需要QDE-2、Dicer、QIP以及RNA外来复合体(exosome)的共同参与(Xue et al.,2012)。