[发明专利]一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA

权利要求书

1.一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，所述香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体为以下3种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体中的任意一种：Δdcl1突变体、Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体；

所述Δdcl1突变体、Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体通过以下方法获得：

1)Δdcl1突变体的构建方法为：

第一轮PCR扩增：

左端LB：FOC4基因组DNA为模板，DCL1-LBCK和DCL1-HPH-LB-R为引物，扩增产物大小1699bp；

右端RB：以FOC4基因组DNA为模板，DCL1-HPH-RB-F和DCL1-RBCK为引物，扩增产物大小1920bp；

潮霉素抗性基因HPH：载体质粒DNA为模板，HYG-F和HYG-R为引物，扩增产物大小1376bp；

第二轮PCR扩增：

左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH为模板，DCL1-LB-F和HYG-R1为引物，扩增产物大小2310bp；

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH为模板，HYG-F1和DCL1-RB-R为引物，扩增产物大小2269bp；

将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行转化，获得Foc4DCL1基因缺失突变体，即Δdcl1突变体；

其中，DCL1-LBCK、DCL1-HPH-LB-R、DCL1-HPH-RB-F、DCL1-RBCK、DCL1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和DCL1-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；

2)Δdcl2突变体的构建方法为：

第一轮PCR扩增：

左端LB：FOC4基因组DNA为模板，DCL2-LBCK和DCL2-HPH-LB-R为引物，扩增产物大小1957bp；

右端RB：FOC4基因组DNA为模板，DCL2-HPH-RB-F和DCL2-RBCK为引物，扩增产物大小1837bp；

潮霉素抗性基因HPH：载体质粒DNA为模板，HYG-F和HYG-R为引物，扩增产物大小1376bp；

第二轮PCR扩增：

左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH为模板，DCL2-LB-F和HYG-R1为引物，扩增产物大小2682bp；

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH为模板，HYG-F1和DCL2-RB-R为引物，扩增产物大小2103bp；

将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行转化，获得Foc4DCL2基因缺失突变体，即Δdcl2突变体；

其中，DCL2-LBCK、DCL2-HPH-LB-R、DCL2-HPH-RB-F、DCL2-RBCK、DCL2-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和DCL2-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:20所示；

3)Δdcl1/2突变体的构建方法为：

第一轮PCR扩增：

左端LB：Δdcl1突变体基因组DNA为模板，DCL2-NEO-LBCK和DCL2-NEO-LB-R为引物，扩增产物大小1881bp；

右端RB：FOC4基因组DNA为模板，DCL2-NEO-RB-F和DCL2-NEO-RBCK为引物，扩增产物大小1973bp；

新霉素NEO抗性基因：载体质粒DNA为模板，NEO-F和NEO-R为引物，扩增产物大小1370bp；

第二轮PCR扩增：

左端LB+NE：左端LB和新霉素NEO抗性基因为模板，DCL2-NEO-LB-F和NEO-R1为引物，扩增产物大小2288bp；

右端EO+RB：右端RB和新霉素NEO抗性基因为模板，NEO-F1和DCL2-NEO-RB-R为引物，扩增产物大小2412bp；

将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行转化，获得Foc4DCL1/2双基因缺失突变体，即Δdcl1/2突变体；

其中，DCL2-NEO-LBCK、DCL2-NEO-LB-R、DCL2-NEO-RB-F、DCL2-NEO-RBCK、DCL2-NEO-LB-F、NEO-R1、NEO-F1和DCL2-NEO-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32所示。