[发明专利]一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法

说明书

本发明公开了一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，包括分析Rab8通过翻译后环节对调节膜表面Klotho表达的作用、分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路及EMT中的作用以及分析Rab8调控Klotho膜表面表达在非小细胞肺癌细胞功能学方面的作用。本发明首次发现，Rab8与Klotho结合，通过蛋白生物合成后途径促进其向膜表面转运，提高Klotho膜表面分布水平，抑制Wnt/β‑catenin信号激活，抑制细胞发生上皮‑间质转化，从而抑制肺癌细胞迁移、侵袭。因此，Rab8具有主动调节Klotho功能。

技术领域

本发明涉及一种蛋白相互作用及相关作用机制的分析方法，具体为一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，属于生物学应用领域。

背景技术

近年来研究者对于Rab8的相关研究兴趣日增。Rab8最初从黑色素瘤细胞中被发现，被认为是转化基因。目前认为Rab8参与了极性化细胞中新合成蛋白的转运，从而参与了细胞形状的调节，以及响应不同的细胞信号。Rab8通过重组肌动蛋白和微管，在膜转运和细胞骨架动力学方面起到串联作用，从而在细胞形态学方面具有重要影响。有报道认为Rab8参与了初级纤毛的形成及物质转运。最近有报道Rab8参与了MT1-MMP的促侵袭活性的调控。有研究发现，Rab8在乳腺癌和转移淋巴结中表达上调，可能与Rab8可以通过MT1-MMP促进细胞迁移有关。也有人报道Rab8在化疗药物顺铂耐药的细胞中表达明显升高，并发现它参与了TMEM205相关的药物抵抗。Rab8调节膜再循环通路，与Arf6，EHD1，Myo5和Rab11相关。有假说认为Rab8在细胞表面结构域形成中具有重要作用。另有研究发现，Rab8激活诱导Rac1和Tiam1，介导皮质肌动蛋白聚合和RhoA依赖性弹性纤维分解。Rab8激活增加Rac1活性，而其缺失时将激活RhoA，导致肌动蛋白细胞骨架的重组。Rab8还和黏着斑、细胞迁移等相关。Rab8的这些功能牵涉到calpain，MT1-MMP和Rho GTP酶等。这些数据表明Rab8通过Rho GTP酶依赖和非依赖两种方式驱动细胞活性，从而调节细胞极性的建立，黏着斑的翻转，以及肌动蛋白细胞骨架重排，决定了细胞迁移的方向。此外，多个Rab8相互作用蛋白被证实与不同疾病相关。

目前对于Rab8功能以及Rab8相关的信号通路仍有很多未知。关于Rab8调控哪些运输通路，Rab8通路的cargo蛋白如受体和接头蛋白，以及Rab8相互结合蛋白方面的信息仍较匮乏。通过免疫共沉淀联合质谱分析，我们发现并证实在非小细胞肺癌中Rab8与Klotho存在相互结合及亚细胞共定位，且Rab8可以促进Klotho蛋白膜表面表达，有必要对Rab8调控Klotho膜表面表达的机制，以及在非小细胞肺癌中的相关作用进一步研究。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，包括以下步骤：

(1)分析Rab8通过翻译后环节对调节膜表面Klotho表达的作用，包括插入和内吞两个相反的受体转运过程的分析，利用切割表面生物素标记技术检测Klotho内化，同时利用一种基于荧光的活细胞比率循环分析方法，以测量Klotho的再循环利用，结果表明Rab8并不参与Klotho内化；

(2)分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路及EMT中的作用，包括利用Western blot检测、免疫细胞化学方法和定量RT-PCR检测分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路中的作用，利用Western blot检测分析Rab8调控Klotho膜表面表达在EMT中的作用；

(3)分析Rab8调控Klotho膜表面表达在非小细胞肺癌细胞功能学方面的作用，包括CCK8检测实验、细胞集落形成实验、划痕实验、Transwell侵袭实验和移植瘤实验。