[发明专利]一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法

权利要求书

1.一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)分析Rab8通过翻译后环节对调节膜表面Klotho表达的作用，包括插入和内吞两个相反的受体转运过程的分析，利用切割表面生物素标记技术检测Klotho内化，同时利用一种基于荧光的活细胞比率循环分析方法，以测量Klotho的再循环利用，结果表明Rab8并不参与Klotho内化；

(2)分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路及EMT中的作用，包括利用Westernblot检测、免疫细胞化学方法和定量RT-PCR检测分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路中的作用，利用Western blot检测分析Rab8调控Klotho膜表面表达在EMT中的作用；

(3)分析Rab8调控Klotho膜表面表达在非小细胞肺癌细胞功能学方面的作用，包括CCK8检测实验、细胞集落形成实验、划痕实验、Transwell侵袭实验和移植瘤实验。

2.根据权利要求1所述的一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述基于荧光的活细胞比率循环分析方法如下：

(1)表达FLAG-Klotho的A549细胞在含有结合Alexa-488的抗FLAG抗体M1的DMEM培养基中4℃下培养30分钟，然后在37℃温暖环境中培养30分钟以促进内化；

(2)迅速用含1mM EDTA的冰PBS洗涤细胞3次，以分离与未发生内化的Klotho结合的Alexa-488抗FLAG抗体M1；

(3)更换含有结合Alexa-594的抗鼠IgG二抗的新鲜培养基，37℃下培养30分钟，以标记循环回细胞表面的Klotho蛋白；

(4)每组实验设立两组平行对照，立即用含4％多聚甲醛的PBS固定细胞；

根据对照组红/绿光比率计算回收蛋白质的百分比，公式如下：

回收蛋白质的百分比＝(E-Z)/(C-Z)×100，

其中E代表回收组平均比率，

Z代表0％回收对照组平均比率，

C代表100％表面对照组比率。

3.根据权利要求2所述的一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述基于荧光的活细胞比率循环分析方法的每个实验中，包括两个平行的对照组，其中一组在没有经过EDTA处理，孵育15分钟固定，作为100％表面对照，另一组是EDTA处理后立即固定细胞作为0％回收对照，利用荧光显微镜Nikon Eclipse TE 2000-U捕捉图像，通过MetaMorph软件循环回收蛋白进行定量。

4.根据权利要求1所述的一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述Western blot检测中的抗体包括Wnt3兔单克隆抗体、Beta-catenin抗体和抗-Active-Beta-Catenin抗体。

5.根据权利要求1所述的一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述定量RT-PCR引物如下：

Cyclin D1-322bp

正义：5’-CCGCTGGCCATGAACTACCT-3’，

反义：5’-ACGAAGGTCTGCGCGTGTT-3’；

C-myc-110bp

正义：5’-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3’，

反义：5’-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3’。