[发明专利]用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体及方法

说明书

本发明涉及一种用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体及方法，所述载体由cfx基因克隆至质粒pBAD24酶切位点KpnI和XbaI获得质粒pBAD24::cfx，然后再将EXpheS*连入质粒pBAD24::cfx的XbaI和SalI酶切位点处，获得基因突变的模板载体，命名为pBAD24::cfx+EXpheS*；然后将突变基因上游序列和突变基因下游序列分别连入pBAD24::cfx+EXpheS*载体的cfx基因上游和EXpheS*下游，即获得用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体；该载体能够简便高效的进行鸭疫里默氏杆菌基因组点突变，进而可以用于鸭疫里默氏杆菌的基因功能的研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体，还涉及利用该载体对鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的方法。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌是一种重要的禽类致病细菌。目前由于缺乏相应的基因编辑工具，所以对鸭疫里默氏杆菌的基因功能及致病机制研究较少且不深入。基因编辑技术对研究基因的功能至关重要。目前可用于鸭疫里默氏杆菌的基因编辑技术主要为基因的缺失及回补，然而如果需要对功能基因的关键区域或关键氨基酸进行研究，则需要对功能基因进行点突变。其中一种方法是通过重叠PCR的方法产生点突变，再将这种含有突变位点的基因克隆到穿梭质粒并转入基因缺失株进行研究。然而这种方法并不能完全反映基因点突变后在基因组本身的情况。另外，穿梭质粒在复制过程中存在丢失的风险。为克服以上的缺陷，急需一种用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体；本发明的目的之二在于提供利用所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体，所述载体由cfx基因克隆至质粒pBAD24酶切位点KpnI和XbaI获得质粒pBAD24::cfx，然后再将EXpheS*连入质粒pBAD24::cfx的XbaI和SalI酶切位点处，获得基因突变的模板载体，命名为pBAD24::cfx+EXpheS*；然后将突变基因上游序列和突变基因下游序列分别连入pBAD24::cfx+EXpheS*载体的cfx基因上游和EXpheS*下游，即获得用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体。

优选的，所述EXpheS*由以pLMF03::pheS*质粒作为模板，SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示序列为引物进行PCR扩增，即获得EXpheS*；所述pLMF03::pheS*质粒由如SEQ IDNO.5所示序列连入穿梭质粒pLMF03而得。

优选的，所述cfx基因由以下方法制得：以质粒pLMF03作为模板，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行PCR扩增，获得cfx基因。

优选的，所述突变基因上游序列由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示序列为引物，鸭疫里默氏杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增而得；所述突变基因下游序列由SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示序列为引物，鸭疫里默氏杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增而得。

2.利用所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的方法，将载体中含有突变基因上游序列、cfx基因、EXpheS*和突变基因下游序列的序列扩增出来，通过自然转化的方法转入鸭疫里默氏杆菌野生株RA ATCC中，将其涂在含有1μg/ml头孢西丁cfx的GCB平板上，筛选出第一次同源重组的阳性克隆，命名为RA ATCCΔRA0C_1912::cfx+EXpheS*，将含有突变基因点突变的序列通过自然转化的方法转入RA ATCCΔRA0C_1912::cfx+EXpheS*中，将其涂在含有13mM p-cl-Phe的GCB平板上，筛选出第二次同源重组的阳性克隆。