[发明专利]用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体及方法

权利要求书

1.用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体，其特征在于：所述载体由cfx基因克隆至质粒pBAD24酶切位点KpnI和XbaI获得质粒pBAD24::cfx，然后再将EXpheS*连入质粒pBAD24::cfx的XbaI和SalI酶切位点处，获得基因突变的模板载体，命名为pBAD24::cfx+EXpheS*；然后将突变基因上游序列和突变基因下游序列分别连入pBAD24::cfx+EXpheS*载体的cfx基因上游和EXpheS*下游，即获得用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体。

2.根据权利要求1所述用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体，其特征在于：所述EXpheS*由以pLMF03::pheS*质粒作为模板，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列为引物进行PCR扩增，即获得EXpheS*；所述pLMF03::pheS*质粒由如SEQ ID NO.5所示序列连入穿梭质粒pLMF03而得。

3.根据权利要求1所述用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体，其特征在于：所述cfx基因由以下方法制得：以质粒pLMF03作为模板，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行PCR扩增，获得cfx基因。

4.根据权利要求1所述用于鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的载体，其特征在于：所述突变基因上游序列由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示序列为引物，鸭疫里默氏杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增而得；所述突变基因下游序列由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示序列为引物，鸭疫里默氏杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增而得。

5.利用权利要求1～4任一项所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的方法，其特征在于：将载体中含有突变基因上游序列、cfx基因、EXpheS*和突变基因下游序列的序列扩增出来，通过自然转化的方法转入鸭疫里默氏杆菌野生株RA ATCC11845中，将其涂在含有1μg/ml头孢西丁cfx的GCB平板上，筛选出第一次同源重组的阳性克隆，命名为RA ATCCΔRA0C_1912::cfx+EXpheS*，将含有突变基因点突变的序列通过自然转化的方法转入RAATCC ΔR A0C_1912::cfx+EXpheS*中，将其涂在含有13mM p-cl-Phe的GCB平板上，筛选出第二次同源重组的阳性克隆。

6.根据权利要求5所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的方法，其特征在于：所述含有突变基因上游序列、cfx基因、EXpheS*和突变基因下游序列的序列由以所述载体为模板，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12所示序列为引物扩增获得。

7.根据权利要求5所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组点突变的方法，其特征在于：含有突变基因点突变的序列由以下方法获得：分别以SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15与SEQ ID NO.16为引物，鸭疫里默氏杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增获得产物后，然后以扩增产物为模板，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.16为引物进行融合PCR获得点突变序列。