[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法

说明书

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法，利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因，破坏CD163受体胞外域SRCR5，敲除CD163基因第7个外显子DNA片段，CD163基因的第7个外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。采用本发明的方法，能够完全抵抗PRRSV感染，包括抗高致病性毒株HP‑PRRSV，而细胞表面CD163受体表达正常，其他生物学功能正常。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说，涉及一种利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse，PRRSV)引起，PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株(Highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome viruse，HP-PRRSV)，目前，高致病性蓝耳病(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)是对养猪业损害最大的疾病之一，由于该病毒具有免疫抑制性、抗体依赖增强性、持续性感染、病毒血症维持时间长等特点，目前尚没有很好的疫苗和药物可以防控蓝耳病。

CD163是单核细胞、猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophage,PAMs)表面特异表达的富含半胱氨酸清道夫受体(cysteine-rich scavenger receptor,SRCR)，一般可作为PAMs细胞Marker。CD163共含有9个SRCR结构域，其中SRCR5在病毒感染过程中发挥主要的作用，有研究表明，SRCR5的缺失或破坏能抑制PRRSV的感染。同时有体外实验证明，SRCR5主要由CD163基因的外显子7负责编码。该发现为构建抗PRRSV的CD163基因编辑动物提供了依据，即通过基因编辑技术结合体细胞核移植的方法，制备出SRCR5被破坏的抗PRRSV的CD163基因编辑动物。有研究报道CD163受体敲除猪可以完全抵抗PRRSV感染，没有任何如发热、呼吸困难等症状，体内检测不到任何PRRSV抗原和抗体，组织切片显示肺部没有被PRRSV感染。

Cas9和gRNA是CRISPR/Cas9系统的基本成分，gRNA用于特异位点识别，Cas9用于切割靶位点DNA。与传统的基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统的构建更加简便、快速、廉价。研究发现，当gRNA的靶位点位于同一条染色体上时，利用Cas9和多条gRNA共转细胞，可以产生两条gRNA靶位点之间DNA片段的删除，DNA片段删除能更有效地敲除目的基因。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效敲除目的基因的利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法。

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法，其利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因，破坏CD163受体胞外域SRCR5，敲除CD163基因第7个外显子DNA片段，所述CD163基因的第7个外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明提供的方法，优选地，用于敲除所述CD163基因的所述第7个外显子的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

所述蓝耳病毒包括经典毒株和高致病性毒株。具体优选地，所述高致病性毒株为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。