[发明专利]一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法

说明书

本发明公开了特异性shRNA筛选及其靶向Ang‑2基因抑制肺癌细胞的验证方法，经细胞复苏、细胞培养、细胞转染、干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang‑2表达、干扰前后细胞中蛋白表达分析、CCK‑8方法检测干扰Ang‑2基因前后的肺癌细胞增殖能力及干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测的步骤完成对特异性shRNA的筛选及其靶向Ang‑2基因抑制肺癌细胞的验证；本发明实现筛选对Ang‑2基因转录干扰具有特异性Ang‑2‑shRNA1有效质粒转染肺癌细胞，同时能够验证了特异性shRNA靶向干扰Ang‑2能够有效抑制癌细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学能力，为治疗肺癌提供一种新的治疗方向，抑制Ang‑2弥补抗VEGFR单一疗法的局限性。

技术领域

本发明属于医学领域，具体涉及一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法。

背景技术

肺癌在当今世界仍然是一种最常见的人类恶性肿瘤以及癌症相关死亡的主要原因，肺癌5年生存率低，术后复发率高，预后差，即使手术后的I期肺癌患者10年生存率可达90%。治疗方法以手术为主，放疗化疗为辅的综合治疗，但由于转移和耐药等原因，使多种化疗药物疗效降低甚至无效。虽然已有多种靶向药物能延长肺癌患者的生存时间，但仍然不能降低肺癌死亡率，仍需探索新的分子标记和分子靶点作为肺癌新的治疗策略。肺癌的发生发展是一个多阶段的复杂病理过程，涉及基因突变、表观遗传学改变及多种信号通路调节异常。对于肿瘤生物学的理解只强化了血管生成在肿瘤发展中的作用，它提供正常生理需求的氧气和营养物质。肿瘤微环境中，肿瘤动态平衡利于促成持续促血管生成状态；没有足够的血管支持，肿瘤的大小将被限制在直径几毫米。

随着肿瘤体积增大，耗氧量增加，使组织缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)过表达，诱导血管生成相关蛋白血管内皮生长因子(VEGF)与血管生成素-2(Angiopoietin, Ang-2)过表达从而影响放化疗，并促使癌细胞更具侵袭性。肺癌组织和细胞中Ang-2表达的生物学特征值得探讨，有可能是影响肺癌患者预后的重要因素。而肿瘤新生血管是为肿瘤细胞输送氧及营养物质的通道，也是实现肿瘤转移的重要通道之一。Ang-2通过竞争性的抑制Ang-1的生物功能，降低了血管的稳定性，继而导致血管的高度不稳定性、不成熟性，在肿瘤的血管生成中起着至关重要的作用。Ang-2介导血管生成和肿瘤进展的详细机制仍有争议。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是目前日趋发展和逐渐成熟的一门新兴的基因沉默技术。Ang-2是调节肿瘤血管生成的关键因子，有研究表明，Ang-2高表达可导致血管内皮细胞和周细胞之间的干扰被持续中断。此外，内皮细胞中高浓度Ang-2通过激活磷脂酰肌醇3′激酶/ Akt信号通路阻断细胞凋亡。在肿瘤转移(如口腔鳞癌)的初始步骤是通过EMT诱导的血管生成，这可通过血管生成的关键因子Ang-2介导。因此可以推测Ang-2过表达与目前肺癌的血管生成侵袭、迁移及转移密切相关，干扰Ang-2表达可能成为肺癌治疗的突破点，因此Ang-2作为预后相关的新靶点，具有开发与应用前景。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种具有开发与应用前景的一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其创新点在于：经细胞复苏、细胞培养、细胞转染、干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达、干扰前后细胞中蛋白表达分析、CCK-8方法检测干扰Ang-2基因前后的肺癌细胞增殖能力及干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测的步骤完成对特异性shRNA的筛选及其靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的验证；

所述干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达的具体步骤包括Total RNA提取、逆转录cDNA和荧光定量RT-PCR。

进一步的，所述细胞复苏的具体步骤为：