[发明专利]一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法

权利要求书

1.一种靶向Ang-2(血管生成素-2)基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其特征在于：经细胞复苏、细胞培养、细胞转染、干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达、干扰前后细胞中蛋白表达分析、CCK-8方法检测干扰Ang-2基因前后的肺癌细胞增殖能力及干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测的步骤完成对特异性shRNA的筛选；筛选出最优特异性shRNA的shRNA-1，所述shRNA-1的序列为：TTACTCA TTGTATGAACAT；

所述干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达具体步骤包括Total RNA提取、逆转录cDNA和荧光定量RT-PCR；

其中，所述干扰前后细胞中蛋白表达分析的具体步骤为：

a.蛋白抽提和浓度测定：PBS冲洗贴壁细胞两遍后，加适量含1%的PMSF及磷酸酶抑制剂的裂解液，冰上裂解15min，用刮板收集细胞，在4℃ 12000r/min环境下离心20min，以BCA法测定浓度；按SDS-PAGE蛋白上样缓冲液体积：蛋白体积=1：4的比例加入蛋白上样缓冲液，并于100℃煮5min，使蛋白变性；所收集到的变性蛋白立即使用或-80℃保存待用；

b.Western blotting免疫印迹试验：

制备10%SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶和5%浓缩胶，所述分离胶的配方为：ddH₂O 1.3 mL，1mol/L PH8.8 Tris-HCl 1.9 mL，30% Arc- Bis 1.7 mL，10% SDS 50 μl，TEMED 2 μl及10%过硫酸铵 50 μl；所述浓缩胶的配方为：ddH₂O 1.4 mL，1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl0.25 mL，30% Arc-Bis 0.33 mL，10% SDS 20 μl，TEMED 2 μl及10%过硫酸铵AP 20 μl；

向电泳槽内加入足量电泳缓冲液，所述电泳缓冲液的配方为：SDS 1g，Tris 3.02 g，甘氨酸 14.4 g，ddH₂O 1 000 mL；

调节所收集的变性蛋白浓度和每个孔上样体积，使每孔上样总量达200μg进行电泳；电泳恒压80 V×40 min，后100 V×1h；

电泳结束后将切好的SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶放入转膜槽内，加入800ml转膜缓冲液进行转膜，恒流300 mA×2h；所述转膜缓冲液的配方为Tris 3.02 g，甘氨酸 14.4 g，ddH₂O600 mL，100%甲醇200 mL；

待蛋白转移至PVDF膜后拿出，使用TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗4次，所述TBST缓冲液的配方为：NaCl 8.0 g，Tris 2.42 g，Tween-20 0.5 mL，ddH₂O 1000 mL；室温下，封闭液脱色摇床封闭1 h；

TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗3次，加入1：1000的兔抗人Ang-2 、1：200倍的鼠抗人E-cadherin、1：2000倍的鼠抗人VIM、1：500倍的鼠抗人Snail、1：200倍的鼠抗人Twist 及1：2000倍的鼠抗人β-actin抗体作为内参，4℃环境下过夜，TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗4次，TBST 缓冲液按1:1000稀释辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育60min，洗涤后ECL显色并拍照；

其中，所述CCK-8方法检测干扰Ang-2基因前后的肺癌细胞增殖能力的具体步骤：

设置实验组：shRNA实验组，阴性对照组和空白对照组，在96孔板中接种对数生长期A549细胞，每孔2000个，每孔100µl；

24小时后进行细胞转染，以CCK8实验，分别检测转染后0h、24h、48h、72h细胞增殖情况，每个时段设置3个复孔；

每孔加入10µl CCK8溶液继续培养120min，用多功能酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度A₄₅₀值，取其均值。