[发明专利]一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物及其方法

权利要求书

1.一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物，其特征在于：所述的烟草花叶病毒属病毒通用检测引物为：

正向引物TobamodF：5’-TKGAYGGNGTBCCNGGNTGYGG-3’，

反向引物TobamodR：5’-ACNGAVTBNABCTGTAATTGCTAT-3’；

所述的检测引物中N可以是A、C、G、T四种碱基中的任意一种，K为G和T中的一种，Y为C和T中的一种，B为C、G、T中的一种，V为A、C、G中的一种。

2.根据权利要求1所述的一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物，其特征在于：所述检测引物对TMGMV扩增出871bp的产物，对PMMoV扩增出877bp的产物，对TMV、ToMV、ToMMV扩增出880bp的产物，对ORSV扩增出889bp的产物，对CGMMV扩增出874bp的产物。

3.一种烟草花叶病毒属病毒通用检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的烟草花叶病毒属病毒通用检测引物进行检测，包括以下具体步骤：

RT反应体系：反转录试剂盒为PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit或 TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV RNase H^- Kit，反应体系的总体积为10μL；PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit具体方法为，将含1-2μL的模板，0.5μL烟草花叶病毒属病毒通用检测引物反向引物，0.5μL 10mmol/L的dNTP mix，2-3μL ddH₂O的混合液，混匀后65℃反应5min，反应结束迅速放冰上冷却，之后加入含2μL的5×Primer Script Buffer，0.25μL 40U/μL的RNase Inhibitor，0.5μL 200U/μL的Primer Script RTase，2.25μL ddH₂O的混合液，之后45℃反应1h，70℃反应15min终止反应；

TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV RNase H^- Kit的具体方法为，将含2μL模板，1μL烟草花叶病毒属病毒通用检测引物反向引物，3μL ddH₂O的混合样混匀后，70℃下反应10min，迅速拿出放在冰上冷却3min，之后加入含2μL 5×M-MLV Buffer，0.5μL 10mM的dNTPmix，0.5μL RTase M-MLV，1μL ddH₂O的混合液，在42℃反应1h，70℃下15min反应结束；

PCR反应体系：PCR扩增试剂盒为2×Es Taq MasterMix，反应体系的总体积为10μL，含5μL 2×Es Taq MasterMix，1μL cDNA模板，0.2-0.4μL烟草花叶病毒属病毒通用检测引物正向引物，0.2-0.4μL烟草花叶病毒属通用引物反向引物， 3.2-3.6μL ddH₂O；

反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，45-55℃退火30s，72℃延伸0.5-1min，循环30-35次；72℃延伸5-10min；4℃终止反应；

反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果。