[发明专利]利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法。

背景技术

基因芯片(gene chip)又称为DNA阵列，为生物芯片的一种，是指将大量DNA或寡核苷酸探针密集排列形成的探针阵列。基因芯片的技术原理是DNA的碱基配对和互补，基础是杂交测序(SBH)。基因芯片采用光导原位合成或微量点样的方法，将寡核苷酸或cDNA有序地固化于支持物的表面，与已标记的待测生物样品的cDNA或cRNA杂交，通过激光共聚焦扫描等特殊设备对杂交信号的强度进行检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。从二十世纪八十年代初SBH概念的提出，到目前的商品化基因芯片在这十几年时间里，芯片的制作技术不断完善、芯片的概念不断延伸、芯片的应用范围不断拓展，使得生物芯片技术对二十一世纪生命科学和医学的发展产生无法估量的影响。芯片所带来的巨大学术价值、社会价值和经济价值引起了多家大公司及多国政府机构的极大兴趣，并投以可观的财力，这又使芯片技术得以迅速发展。

目前基因芯片按功能可以分为表达谱基因芯片和DNA测序芯片两大类；按探针的长短可分为长探针芯片和短探针芯片。

基因芯片是后基因组时代一项重要技术，它的出现为中医药学的现代化提供了一个很好的切入点，其特点是可以在同一时刻对成千上万个基因的表达情况进行分析，形成完整的细胞基因表达谱，解决了传统中药药理研究方法周期长、耗时多、产出少的问题。微血管内皮细胞能够通过其分泌功能发挥信息的传导和调节功能，保证血液与组织液之间、血液与淋巴液之间以及血液本身的有形成分与血浆之间复杂的生理、生化以及血流动力学的内环境平衡，同时分泌多种细胞因子和局部激素，参与一系列生理和病理过程。但是在现今的微血管内皮细胞的相关研究领域中，基因芯片技术的应用还不是很普遍。张斌等应用基因芯片技术分别检测正常浓度和高浓度D-葡萄糖培养基中培养后内皮细胞的基因表达谱。结果表明高糖可能通过影响微血管内皮物质代谢、信号转导、细胞膜结构和细胞外基质等的表达而导致血管内皮功能紊乱，为进一步研究高糖对微血管内皮细胞基因表达谱的影响提供资料。YμE Fei等采用基因芯片技术研究了碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对小鼠脑微血管内皮细胞(microvascμlar endothelial cell,MVEC)株bEnd.3中血管新生相关基因表达谱的改变，结果提示：bFGF具有上调促血管新生基因表达，下调抑制血管新生基因表达的作用，两者协同作用，促进血管新生。

发明内容

本发明解决的一个技术问题就是通过对小檗碱诱导体外培养的RMMVECs产生的差异性基因表达谱的分析，来探讨提高微血管舒缩活动振幅的分子机制，从基因表达水平充分验证了，提高微血管舒缩活动振幅的中药有效成分Ber能双向调节RMMVECs相关细胞因子的表达，维持细胞因子分泌的平衡，维持MVECs的正常生理功能，从而阻断了致病因子对微血管内皮细胞的伤害，发挥治疗疾病的作用。

为了解决上述问题，本发明提供一种利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法，包括以下步骤：

(1)制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs；

(2)培养二代RMMVECs，将小檗碱溶解于维持培养基中，浓度为10μg/ml，在37℃、5％CO₂的条件下，将RMMVECs继续培养9h；

(3)将RMMVECs充分裂解，提取总RNA；

(4)纯化、定量总RNA；

(5)反转录合成First-strand cDNA；

(6)合成Second-strand cDNA；

(7)体外转录合成cRNA；

(8)cRNA反转录；

(9)荧光标记后进行基因芯片杂交，最后进行数据分析。

所述方法，步骤(1)中采用差速贴壁法对所制备的RMMVECs进行纯化。

所述方法，步骤(3)中充分裂解的方法为：将RMMVECs用37℃预热的PBS清洗3遍，加入2ml Trizol溶液，静置5min，用移液枪吹打，使RMMVECs充分裂解，转入离心管，于-80℃冰箱保存待用；