[发明专利]利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法

权利要求书

1.利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法，其特征在于：包括以下步骤： 

(1)制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs； 

(2)培养二代RMMVECs，将小檗碱溶解于维持培养基中，浓度为10μg/ml，在37℃、5％CO₂的条件下，将RMMVECs继续培养9h； 

(3)将RMMVECs充分裂解，提取总RNA； 

(4)纯化、定量总RNA； 

(5)反转录合成First-strand cDNA； 

(6)合成Second-strand cDNA； 

(7)体外转录合成cRNA； 

(8)cRNA反转录； 

(9)荧光标记后进行基因芯片杂交，最后进行数据分析。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中采用差速贴壁法对所制备的RMMVECs进行纯化。 

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中充分裂解的方法为：将RMMVECs用37℃预热的PBS清洗3遍，加入2ml Trizol溶液，静置5min，用移液枪吹打，使RMMVECs充分裂解，转入离心管，于-80℃冰箱保存待用； 

提取总RNA的方法为：将于-80℃冰箱保存的溶于Trizol液中的细胞样品解冻，12000rpm，4℃离心5min，弃沉淀，将上清转入一新的离心管内；按Trizol：氯仿为5：1的体积量加入氯仿，剧烈振荡混匀至粉牛奶状，室温静置3min，12000rpm，4℃离心15min，取上清至一新离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置5min，12000rpm，4℃离心15min，可见白色RNA沉淀；弃去上清，缓慢地沿管壁加入75％乙醇1ml，使沉淀悬浮于乙醇中，7500rpm，4℃离心15min；弃去上清，再加入75％乙醇1ml，重复上步；而后吸去所有上清，待残余乙醇挥发尽后加入50μl DEPC水溶解RNA 沉淀，-20℃冷冻保存。 

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中反转录合成First-strand cDNA的方法步骤为： 

A.取总RNA500ng，调整体积到4μL； 

B.加入基因表达谱外参1μl； 

C.配制反转录Master Mix，其中First Strand Bμffer Mix4μL，First Strand Enzyme Mix 1μL，轻轻混匀，短暂离心置于冰上；取配好的5μL Master Mix分别转移至含有总RNA样品的0.2mL离心管中； 

D.轻轻混匀溶液，瞬时离心后42℃反应2小时；将PCR仪的热盖温度也设置成42℃，避免溶液蒸到管壁上；反应完后冰浴5分钟。 

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中合成Second-strand cDNA的方法步骤为： 

A.配制Second-strand Master Mix，其中Nμclease-free Water 13μL，Second-strand Bμffer Mix 5μL，Second-strand Enzyme Mix 2μL，轻轻混匀，短暂离心后冰浴；取上步反应完毕的样品管中加入配好的20μL Second Strand Master Mix； 

B.轻轻混匀，16℃反应1小时，65℃ 10min； 

C.反应结束后将反应物置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于-20℃。 

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(7)中体外转录合成cRNA的方法步骤为： 

A.cRNA合成：配制体外转录Master Mix，其中Nμclease-free Water4μL，T7 Bμffer Mix 20μL，T7 Enzyme Mix 6L，轻轻混匀，短暂离心，往上一反应中准备好的样品管中加入30μL Master Mix； 

B.轻柔混匀，40℃反应16.5小时； 

C.反应完成后，准备纯化cRNA； 

D.纯化、定量cRNA。