[发明专利]一种人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种人羧酸酯酶CES2（Carboxylesterase2）的高特异性荧光探针及其应用。 

背景技术

羧酸酯酶（Carboxylesterase，CES）是机体内重要的一相水解代谢酶，催化多种内源性和外源性化合物发生酯键断裂，释放出极性的醇和羧酸分子片段，后者进而被体内CYP450或UGTs等其他代谢酶继续催化代谢，使药物分子更有效地被排出体外。多种结构中含有酯键的药物分子，如盐酸伊立替康（irinotecan，CPT-11）、奥司他韦（达菲）、氯吡格雷等均被羧酸酯酶催化进行活化或代谢消除。 

人体内介导药物代谢的羧酸酯酶主要分布在2个家族：CES1和CES2，其中CES1又可继续被分为CES1b和CES1c两种亚型。CES1和CES2具有不同的组织分布特异性及底物选择性，人的肝脏中主要分布表达CES1，同时表达一定量的CES2，而小肠中则基本以CES2亚型为主，只有极少量的CES1分布。近年来发现多种肿瘤细胞中CES2的表达水平上调，可借助此特征设计经CES2特异性水解的抗肿瘤前体药物实现靶向选择性杀伤肿瘤细胞的目的。此外，多数口服前药需先经过肠道才能被吸收进入血液循环，因此肠道中CES2酶对酯类药物的代谢被认为是其首过代谢的重要组成部分，CES2酶活的差异对于前体药物的生物利用度具有十分重要的影响。此外，有些经静脉给药的前体药物，如盐酸伊立替康，会经过胆汁排泄被分 泌到肠道中，继而被肠道中的CES2催化水解释放出毒性代谢产物SN-38，后者被认为是导致伊立替康迟发型腹泻副作用的主要原因。因而，建立基于探针的高通量技术手段，对于筛选CES2的高效抑制剂并将其应用于减缓伊立替康导致的迟发型腹泻，以及对CES2功能的定量检测都十分重要。 

本发明提供了一类3-羟基黄酮酯类衍生物及其作为CES2酶荧光探针底物的应用，其经羧酸酯酶CES2水解后可生成荧光发射波谱不同于原型的水解产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种人羧酸酯酶CES2（Carboxylesterase2，CES2）的特异性荧光探针底物及其应用，该底物原型和水解产物的荧光发射波长具有明显差异，且产物更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中CES2的分布和功能进行定量评价。 

本发明提供了一种人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物，该底物的酯键可被CES2特异性水解为相应水解产物并显示与底物不同的发射波谱； 

该底物是以3-羟基黄酮类化合物为原料，通过酯化反应获得相应3-羟基酯类衍生物，其结构通式如式（1）所示，其中，R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。 

如当R为4-乙基苯基时，该底物为3-羟基黄酮酯类衍生物。 

本发明还提供了所述人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物的应用，该底物作为CES2的特异性底物，可利用其水解反应活性，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定不同酶源中CES2的活性；具体测定方法为： 

——体系中以3-羟基黄酮酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10K_m；单点测定时底物浓度优选K_m。 

——在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值； 

——反应时间为5～120分钟，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20%时终止反应； 

——测定单位时间内水解产物生成量作为羧酸酯酶CES2活性的评价指标。 

本发明提供的人羧酸酯酶2的高特异性荧光探针底物的应用，所述酶源为重组表达的CES2单酶、人或动物组织制备液、或各类组织细胞生物样品。 

本发明提供的人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物的应用，所述 底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1%～20%之间。