[发明专利]一种合欢叶片中的内生菌H6菌株分离方法及其应用

说明书

本发明涉及一种合欢叶片中的内生菌H6菌株分离方法及其应用，该分离方法包括：采用75%（体积分数）酒精浸泡2min，再用10%次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗2‑3次，可达到合欢叶片表面最佳的消毒效果和内生菌H6分离的最适条件。本发明经试验证明H6菌株、发酵液、无菌株发酵液及其从H6发酵液中分得的活性组分对供试的植物病原菌苹果腐烂病菌，葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌等均具有较强的抑制作用。本发明采用液‑液萃取法对内生菌H6的代谢液提取，得10个组分，其中活性高的组分1、2和8样品硅烷化衍生后进行GC‑MS检测，鉴定出其中脂肪酸、芳香酸、环二肽、甾醇类等25种具抗菌活性的物质。

技术领域

本发明涉及一种新筛选的合欢内生细菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名H6解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），保藏号：CGMCC No.：7990；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间：2013年8月13日。该菌及发酵液中的活性成分对可引起植物病害的病原真菌具有显著的抑菌活性，可制备成生物农药，用于田间病害的防治。

技术背景

合欢内生菌H6（保藏编号CGMCC No.：7990）自山东省青岛市城阳区青岛农业大学校园内种植的合欢（Albizzia julibrissin Durazz.）叶片中筛选出的具有抑菌活性的内生细菌，经过大量室内实验研究结果表明它对苹果腐烂病菌、葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌等植物病原菌具有较高的生物活性，可用于相应田间病害的防治。

长期以来，我国农药生产以仿制为主，知识产权的保护和市场竞争的形势迫使我国必须将创制新药的研究放在重要位置。我国天然药物资源丰富、经济基础相对比较薄弱，从天然产物中寻找创新药物适合现阶段国情。随着分离分析技术的进步，许多结构复杂及微量成分获得纯品并确定其化学结构成为可能，极大地丰富了天然药物的来源。近几年，药用植物新资源的寻找集中在其内生菌方面。传统药用植物中都存在很多内生菌，其在进化过程中发生了基因重组，获得了宿主的某些基因，能够产生与宿主植物相同或更新颖的代谢产物，有研究显示，5l％的从植物内生真菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物，其化学结构种类远远高于植物本身及土壤微生物。已有报道其代谢产物具有抑菌、抗氧化及抗肿瘤等多种活性，这一特点使药用植物内生菌成为人们寻找天然药物和生物活性物质的新方向，同时在保护珍稀濒危植物方面也具有重要价值。

合欢（Albizzia julibrissin Durazz.）系豆科合欢属植物，产于我国黄河流域及以南各地，朝鲜、日本、越南、印度等地也有分布，资源非常丰富。合欢花的干燥花序，是常用中药。现代研究表明，由于合欢本身含有机酸、甾醇及其苷、黄酮类化合物、神经酰胺及神经鞘苷等多种活性物质，具有抗过敏、抗肿瘤、抗炎抗菌、免疫增强、镇静安神、抗抑郁、抗氧化等多种药理活性作用，越来越引起国内外相关学者的关注。赵杰等研究表明合欢叶提取物对黄瓜霜霉病有很好的预防作用。杨秀娟等研究表明，合欢叶提取物在24h内对南方根结线虫的抑制率在50％以上，且其杀卵率达到81.41%。刘峰等初步研究了合欢叶提取物对油菜茵核病菌的抑制作用，金玉兰与贾福丽研究表明，合欢茎叶正丁醇萃取物对油菜菌核、苹果腐烂病、辣椒炭疽病等病菌均有一定的防治效果，说明合欢茎叶提取物中确实存在抑菌物质，而且具有一定的抑菌谱。对于合欢中内生菌的研究，至今仅见国内有零星报道，缪莉等自合欢树皮中分离出7株内生菌用于抗肿瘤活性的筛选。杨嘉等从不同地区的合欢组织中分离到268株内生真菌菌株，进行了总抗氧化活性的筛选。郑志斌从采集到的合欢组织中分离、纯化得到5株内生真菌，通过产孢形态进行菌种鉴定。鉴于合欢叶的提取物具有良好的杀菌、抗肿瘤、抗氧化活性，从其中分离出的内生菌也具有多种生物活性，具有进行深入研究的必要，本发明基于前期近三年的自合欢叶中进行具抗菌活性的内生菌分离筛选，经试验研究发现，合欢内生细菌H6菌体，发酵液、无菌代谢产物、发酵液中活性组分均具有较强的抑菌活性。

发明内容