[发明专利]一株共生真菌及其在铁皮石斛组培与种植阶段的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株共生真菌及其在铁皮石斛组培与种植阶段的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

铁皮石斛又称黑节草，属兰科石斛属，为兰科多年生附生草本植物，是一种珍贵的野生药用植物。铁皮石斛具有独特的药用价值，秦汉时期的《神农本草经》记载铁皮石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃”。现代研究表明铁皮石斛具有抗肿瘤活性；能显著降低血糖水平，促进循环、扩张血管、降低血胆固醇和甘油三酯；对于防治老年白内障和保护少儿视力也有明显效果;具有抗氧化、抗诱变活性等作用。

[0003]由于野生铁皮石斛对自然生态条件要求极其苛刻，自然繁殖率又极低，早在上个世纪八十年代，铁皮石斛就被国家列为重点保护的珍惜濒危药用植物。铁皮石斛同时也是一种真菌共生植物，这些真菌提高了铁皮石斛对养分的吸收能力，同时能促进铁皮石斛的生长。通过菌种诱变，并且筛选出优良的共生菌种，不仅可以促进种子萌发，提高组培苗的出瓶成活率和生长速度，而且还能提供矿物营养、产生维生素和激素类物质等，从而促进铁皮石斛的生长发育。

发明内容

本发明的目的是提供一株铁皮石斛的共生真菌，使铁皮石斛在组培和大田培养阶段存活率，生长速率大幅度提高。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一株共生真菌(Epulorhiza sp.) Es-N235，已于2013年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2013274。

所述的共生真菌Es-N235在铁皮石斛组培与种植阶段的应用。

本发明所述的共生真菌的筛选方法是：从浙江雁荡山野生铁皮石斛新鲜营养根中分离纯化得到共生真菌瘤菌根菌作为出发菌株，经低能氮离子注入诱变后，利用PDA培养基，挑选出诱变后的共生真菌，再利用共生培养，筛选出能够提高组培存活率的菌株，再通过大田无土栽培复筛，筛选出能够缩减生长周期，提高种植存活率的菌株作为下一轮诱变的出发菌株。重复上述过程，直到筛选出目标菌株Es-N235。

本发明菌株Es-N235的形态学及生理化学特征如下：

   菌落颜色：米白色；                 

   需氧方式：兼性厌氧；

   菌落大小：6~10mm；

   适宜生长温度：25~30℃；

   适宜生长PH：6.0~7.0；

   菌落形态：圆形；

   革兰氏染色：阳性。

   本发明所提供的共生真菌Es-N235诱变方法，具体步骤如下

 （a)、单孢子悬浮液制备：将出发菌株孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为10⁶/毫升。

（b)、低能氮离子注入诱变：取0.1ml的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在25KeV,注入剂量为160×10¹³ions/cm³下对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用1ml无菌水洗脱，涂布到PDA培养基上，在25~30℃下倒置培养2~3d。

（c)菌种扩大培养：将步骤(b）PDA培养基培养的共生真菌接种至斜面培养基培养，培养温度为25~30℃，培养时间为2~3d；再将共生真菌的斜面培养物接种至种子培养基培养，培养温度为25~30℃。摇瓶装液量10%~30%。培养时间12~24h；

(d）共生培养初筛：将步骤（c）扩大培养后的菌种接入铁皮石斛无菌组培的培养基共同培养，光照强度3000~8000Lux，筛选共生效率高，铁皮石斛苗存活效率、生长速率都提高的菌株。

（e）大田种植复筛：将步骤（d）中筛选出的共生培养植株移植到大田培养，培养温度25~30℃，光照强度5000~8000Lux，光照时间12~16h/d。筛选共生效率高，铁皮石斛植株大田存活率、生长速率都提高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株。

重复上述过程，直到筛选出目标菌株Es-N235。

在上述筛选方法中：步骤（b)所采用的PDA平板培养基包含如下质量百分数成分：马铃薯煮汁20%~30%，碳源5%~10%,无机盐0.03%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，培养温度为25~30℃；其中所述碳源为葡萄糖，蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为钠盐，钾盐，或者镁盐中的一种或几种混合。