[发明专利]一种利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物小分子提取纯化技术领域，特别涉及一种利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法。

背景技术

孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin，缩写PMSG)分子由α及β亚基组成，α亚基由96个氨基酸组成，β亚基由149个氨基酸组成，分子量大致为39500(决定于含糖量)，含糖量为45％左右，其中唾液酸为10.8％～12.1％，等电点PI 2.6-2.65，易溶于水，干燥时稳定。PMSG具备用于牲畜繁殖中促卵泡素及黄体生成素的双重性质，对雌性动物可促进卵巢中卵泡发育及黄体生成，对雄性可促进睾丸精细管中精子生成及睾丸间质细胞分泌。

我国具有丰富的马匹资源，采集50-120天的健康孕血，其中含高滴度的激素，提纯后可用于动物繁殖、品种改良及生物技术研究方面，用途广泛。随着我国畜牧业由粗放型向集约化发展，特别是当前国家推广的工厂化高效养殖中，PMSG在工厂化高效养羊(牛)配套技术中，用于超数排卵(可使单胎动物产双胎或多胎)、同期发情(规模化生产中的关键技术)、同期受孕，大大提高生产效率，便于管理和操作，因此受到学术界和用户的高度重视和欢迎，展现了极好的市场前景。既解决了因过度放牧而造成草场退化的生态环境保护问题，又实现了高效生产，用户收益大幅度增加，兼顾了经济效益和社会效益，保护了生态环境。

目前，现有的PMSG制备工艺需严格控制酸沉淀、盐析、低温酒精沉淀的各种提取参数，生产工艺繁琐，劳动强度大，技术方法不够先进，严重制约了PMSG的生产和应用。如中国专利CN1872088A公开了一种兽用血促性素生产工艺，取孕马血清用等量蒸馏水稀释，边搅拌边加固体硫酸铵，用浓氨水调pH，充分搅拌后，滤布过滤，清液滴加偏磷酸调pH，滤布过滤。清液经中空纤维超滤器浓缩，使体积浓缩至原体积的40～50％左右，缓慢加入预冷酒精，使40％乙醇沉淀，用浓氨水调pH，静止分层后，虹吸上清，加预冷医用酒精，用冰醋酸调pH，静止分层后，虹吸法吸弃上清，剩余的部分混浊液离心取沉淀。将此沉淀用生理盐水溶起，透析，酒精沉淀，沉淀物置干燥器中负压抽气至干燥。该工艺用到酸处理，多次使用乙醇，导致部分促性腺激素蛋白失活，且整个工艺流程较长，增加了促性腺激素蛋白丢失，所以回收率较低(平均活性回收率为60％)。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目在于建立一种基于抗体亲和层析的高效孕马血清促性腺激素纯化方法，用于规模化生产孕马血清促性腺激素。

本发明的目的是这样实现的：

一种利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法，包括如下步骤：

(1)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体；

(2)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱；

(3)通过抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱纯化孕马血清促性腺激素。

所述的利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法，优选包括如下步骤：

(1)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体：用孕马血清促性腺激素免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的杂交瘤细胞，体内接种杂交瘤细胞，制备腹水，腹水离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用protein A亲和层析柱，或者辛酸-硫酸铵沉淀法纯化出抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体；

(2)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱：将步骤(1)所得抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体与活化的Sepharose2B或Sepharose4B连接，得免疫亲和层析柱；

(3)通过抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱纯化孕马血清促性腺激素：取孕马血清，上样所述免疫亲和层析柱，依次用0.1M Na₂HPO₃，0.15M NaCl，pH 7.5溶液洗去杂蛋白，用0.1M Tris-醋酸，2.0M NaCl，pH7.7溶液洗脱并收集，收集液经0.01M Na₂HPO₃，0.15M NaCl，pH 7.2溶液透析，过滤浓缩，得孕马血清促性腺激素纯品。

与现有技术相比，本发明涉及的孕马血清促性腺激素生产方法具有如下优点和显著进步：