[发明专利]一种制备CIK细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备CIK细胞的方法,属于生物技术领域。

背景技术

肿瘤生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗模式。CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性，是目前国际上公认用于肿瘤生物治疗最有效的细胞之一。与过去过继免疫治疗所使用过的淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer，LAK)和CD3单抗活化的杀伤细胞(CD3AK)相比，CIK细胞具有更强的细胞增殖能力和更强的抗肿瘤细胞作用，且毒副作用较小。

CIK细胞治疗肿瘤的疗效主要取决于输注细胞的数量和杀伤活性。目前传统的CIK细胞制备方法是先分离出外周血中的单个核细胞，用适合于淋巴细胞的培养液，加入适量的CD3单克隆抗体、IL-2，IFN-γ等细胞因子将淋巴细胞培养成CIK细胞。如《CIK细胞的制作及对不同肿瘤细胞株体外抗肿瘤作用的研究》（隋承光等，中国医科大学学报，第34卷，第3期，210-211）公开了一种传统的CIK细胞制备方法，采集外周血单个核细胞（PBMC），经人淋巴细胞分离液梯度分离，取界面层细胞，PBS洗涤2次，悬浮于AIM-V无血清培养基中，调整细胞浓度1×10⁶/ml，于当日加入IFN-γ，24h后加入CD3McAb，IL-2，IL-1α,在37℃,5%二氧化碳孵箱中培养制成。该方法利用IFN-γ使CIK细胞大量扩增，但CIK细胞的杀伤活性却随着细胞的扩增有下降的趋势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中制备CIK细胞的方法在使CIK细胞大量扩增的同时，CIK细胞的杀伤活性却下降的问题，进而提供一种既可以保证CIK细胞的数量，又可以提高其杀伤活性的制备CIK细胞的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种制备CIK细胞的方法，包括以下步骤：

a、从外周血中采集和分离单个核细胞；

b、将步骤a得到的单个核细胞置于适于淋巴细胞的培养基中，加入CD3单克隆抗体、IL-2，IFN-γ，将淋巴细胞培养成CIK细胞；

c、在步骤b的培养液中培养8-15天后，再加入IFN-α和IL-2继续培养2-6天。

所述步骤c培养液中IFN-α的含量为100u/ml-1000u/ml，IL-2的浓度为100u/ml-500u/ml。

所述步骤c培养液中IFN-α的含量为500u/ml，继续培养的时间为3天。

所述步骤a中所述分离单个核细胞是经人淋巴细胞分离液密度梯度分离，经贴壁除去单核细胞。

所述步骤b中培养基为无血清培养基。

所述步骤b中细胞浓度为0.5×10⁶/ml-1.5×10⁶/ml，CD3单克隆抗体10ng/ml-70ng/ml，IL-2浓度为100u/ml-500u/ml，IFN-γ浓度为100u/ml-1000u/ml，培养时间为72h以上。

所述步骤b中细胞浓度为1×10⁶/ml，CD3单克隆抗体50ng/ml，IL-2浓度为3000u/ml，IFN-γ浓度为1000u/ml。

本发明还涉及一种所述方法制备的CIK细胞。

本发明所述的技术方案相对于现有技术具有以下优点：

本发明首先按照常规方法将T淋巴细胞制备成CIK细胞，当细胞扩增至能满足临床治疗的细胞量时，加入IFN-α继续培养，既可以保证CIK细胞的数量，又可以提高其杀伤活性，MTT法检测表明利用本发明方法培养的细胞较不加IFN-α培养的细胞对肿瘤细胞的杀伤性能高50%-1000%。经过对100多例临床恶性肿瘤患者治疗，有效率（PR+CR+MR+SD）达到76%，其中PR+CR+MR达50%，不但提高了肿瘤晚期病人的生存期，还提高了病人的生存质量。

具体实施方式

实施例1