[发明专利]一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂及其制备方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂及其制备方法，以及能高产量重组表达人NT-proBNP的方法，属于医药生物技术领域。

【背景技术】

利钠肽（NP）家族现在越来越受到重视，大多数人类利钠肽家族是由心脏分泌的，并起到控制水盐平衡、维持压力调节稳态等作用。心血管利钠肽内分泌组分包括ANP、BNP、CNP、DNP和VNP。尽管分型各不相同，但是大多数种类的利钠肽在相同种属间的进化是相当保守的。在种属内存在差异的（哺乳动物）只有BNP及其氨基末端前体BNP（NT-proBNP）。

B型利钠肽除了具有利钠肽共有的那些功能外，还可能具有抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统、抗心肌纤维化、强松弛性等作用。BNP主要在心脏表达，尤以心房表达更加丰富。另外，BNP的释放受到压力和容量两种因素调节，进而能预示出心室容积扩大、左室舒张末期压增大，心室超负荷以及心脏损伤程度等一系列心血管异常情况。

NT-proBNP是在BNP前体（proBNP）形成BNP过程中产生的一种无生物活性的蛋白，在代谢过程中，产生的BNP与NT-proBNP含量相同，所以NT-proBNP与BNP同样可以作为一种心脏标志物。但是NT-proBNP缺乏主动清除机制，NT-proBNP在体液中的半衰期要长，浓度更大，更容易检测，并且检测样本更容易获得，因此其已经成为一种主要的心脏检测指标。

2011年9月29日，世界心脏联盟在第12个“世界心脏日”上提到心血管病是威胁人类健康的“第一杀手”，每年全球有1710万人死于心血管疾病，约占全球死亡人数的1/3。2010年中国心血管病报告指出，我国人群心血管病（心脏病、脑卒中）的发病和死亡率呈持续上升阶段。估计全国心血管病2.3亿人，全年死于心血管病300万人，占总死亡原因的41%，居各种死因的首位。大多数的心血管病都是可以通过减少诱因，早期诊断等手段进行预防的。

1991年DzauV等提出的心血管病时间链，自此，人们开始认识到心血管病不是一种独立的突然发生的病症，而是许多相互联系的因素不断发展的过程。心力衰竭处于心血管事件链的末期，早期诊断对于心衰来说，尤为重要。目前心衰常用的诊断方法主要有几种，但是都有各自的局限性。症状判断如呼吸困难、水钠潴留等在诊断时不能特异性诊断。辅助检查如心电图、胸片、肺功能等缺乏标准化的判断标准，因此对结果的阐述具有主观性。实验室检查如血小板计数，甘油三酯等，虽然客观但不便于检测心衰的预后和治疗。影像学检查如心脏超声是心衰诊断的“金标准”，但不同中心检查的结果没有可比性，而且价格高不便于实时监测及常规检查。

自2006年11月12-15日在伊利诺伊州芝加哥举办的美国心脏协会科学会议上许多新生物标记检测带头人进行讲座并阐述了NT-proBNP的临床意义后，NT-proBNP检测在世界范围内推广起来，许多医院实验室被要求进行NT-proBNP的检测。NT-proBNP免疫检测的问世，解决了以上诊断方法的很多问题。NT-proBNP检测客观、能够实现定量、重复性好、特异性高、敏感快速，所以该诊断检测自问世以来，被誉为“划时代的心衰标志物”。NT-proBNP不仅可以用于心衰治疗，目前许多文献报道NT-proBNP可以用于心肌损伤、血栓、炎症、血脂状态、2型糖尿病等其他疾病诊断，未来具有良好的应用前景。

2000年11月22日，美国FDA首次批准了Biosite Diagnostics公司的BNP辅助诊断试剂盒。2002年11月19日，首个NT-proBNP免疫检测试剂盒由罗氏诊断公司制造并上市。虽然NT-proBNP检测已经广泛应用，但是目前并没有统一的标准品。NT-proBNP标准品是目前国内诊断市场亟待解决的一个问题。

由于NT-proBNP目前已经作为生化检验中重要的一种检测指标，因此NT-proBNP标准品目前在临床应用广泛，NT-proBNP标准品的用量非常大，目前常用的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、毕氏酵母表达系统、真核细胞表达系统等。然而，真核表达系统投资巨大，表达周期长，生产条件要求高。并且NT-proBNP氨基酸结构简单，并没有复杂的翻译后加工过程，所以选择大肠杆菌表达系统是经济实用，表达产率高，纯化工艺简单的一种生产策略。目前，市面上的NT-proBNP标准品大多是采用大肠杆菌表达系统表达后再纯化的产品。因其需求量大，因此需要能高产量重组表达NT-proBNP的方法。