[发明专利]微生物样品快速检测方法及其实施检测装置

说明书

技术领域

本发明涉及微生物样品检测技术，特别是涉及利用介孔生物芯片对生物样品进行快速检测的方法，以及用于实施该方法的微生物样品快速检测装置。

背景技术

病原微生物是看不见的危害，一直是人们所关注的热点问题，其污染是一个重大的安全问题，严重影响人类的健康。据世界卫生组织的估计，全球每年有数十亿人由于病原微生物而感染疾病。发达国家发生率也相当高，平均每年有1/3的人群感染。我国江苏、安徽等地2001年发生大肠杆菌O157：H7污染，造成2万人中毒，177人死亡的后果。沙门氏菌每年都会引起的数以百人的中毒事件爆发。上世纪80年代的上海，因为生吃毛蚶造成30万人罹患甲肝。据国家卫生部统计，仅2011年第三季度微生物性食物中毒事件就发生35起，中毒人数达2279人，死亡5人，分别占总报告起数和中毒人数的47.9%和70.7%。引起中毒的主要微生物包括副溶血性弧菌、葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌。瘦肉精、三聚氰胺等化学污染物固然可怕，可由致病微生物引起的食源性疾病确是食品安全的头号问题。

病原微生物的检测技术是预防和控制致病微生物引起的食源性疾病的关键技术环节。常规的检测技术大多依靠培养目标微生物的方法来确定样品是否受到此微生物的污染，包括增菌、分离培养、形态观察、生化鉴定等步骤。这种方法准确性、灵敏性都很高，但涉及的实验较多，操作烦琐，所需时间长，自动化程度低，而且一般一个检验程序只针对一种菌，不适于批量、大范围快速检测。为克服其不足，人们开发出了多种基于不同原理的新型快速检测病原微生物的技术，这主要有聚合酶链式反应法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等。其中聚合酶链式反应是一种体外选择性扩增DNA或RNA的技术，即模板DNA引物以及4种脱氧核糖核苷三磷酸在DNA聚合酶的催化作用下所发生的酶促集合反应，由变性、退火、延伸3个步骤组成，应用该技术能在短时间内对特定DNA序列作百万倍扩增。基因扩增的技术设备由三部分构成：①模板DNA制备所需设备，主要为高速微量离心机或高速冷冻离心机；②PCR基因扩增仪；③DNA扩增结果判读和测定设备，主要有水平低压电泳仪、PCR核酸电泳槽以及紫外透射仪和DNA微量荧光计等，设备大，价格贵，不适应于野外作业。病原微生物检测中运用的PCR技术，大多是基于DNA水平的检测技术，虽然快速特异，灵敏度较高，但最大问题是核酸污染和死菌造成假阳性和定量困难，其测定结果表现为有或无，仅可定性判别，无法定量分析。酶联免疫吸附法，使用酶标仪作为配套仪器，具有很强的敏感性和特异性，但是需要反复洗板，操作复杂，费时费力。胶体金免疫层析法简便快速，只需将处理好的样品加入金标定量仪中试纸条的样品孔内即可判定结果，但是存在敏感性低的缺点，一般是定性测定，不能对相应的检测板读出数据，优良的金标诊断试剂也只能做到半定量。

发明内容

针对现有技术的微生物快速检测技术的现状，本发明的目的旨在提供一种新的微生物快速检测方法以及用于其实施的快速检测装置，以克服现有微生物快速检测技术存在的只能进行定性测定，检测敏感性低，操作复杂，费时费力，设备大，价格贵，不适应于野外作业等不足。

本发明解决其技术问题的微生物样品快速检测方法，主要包括以下工艺步骤：

（1）将抗体固定在介孔生物芯片微孔孔道面上；

（2）将待测溶液泵入流过介孔生物芯片的微孔孔道，使待测溶液所含待测物与固定在微孔孔道面上的抗体反应形成抗原-抗体复合物，富集在微孔道内；

（3）将缓冲溶液泵入流过介孔生物芯片微孔孔道，对富集在微孔孔道内的抗原-抗体复合物进行冲洗，洗除杂质； 

（4）将含有荧光标记抗体或酶标记抗体的溶液泵入流过介孔生物芯片的微孔孔道，使溶液中的标记抗体与抗原-抗体复合物中的抗原进行免疫反应，形成夹心式结构的免疫复合物负载在抗体-抗原-标记抗体复合物上；当标记抗体为酶标记抗体，则需在免疫反应后泵入催化反应溶液进行酶催化显色反应，形成有色物质吸收检测光，或者泵入酶促反应发光剂，进行酶催化发光反应，产生化学发光；

（5）将缓冲溶液泵入流过介孔生物芯片微孔孔道，冲洗游离的标记抗体；

（6）用测量光对介孔生物芯片微孔孔道内的抗体-抗原-标记抗体复合物进行照射，激发荧光标记抗体发出荧光，或者酶催化显色反应形成有色物质吸收测量光形成透射光，或者酶催化发光反应产生化学发光，介孔生物芯片出来的检测光由透镜聚焦耦合到光纤，传输到光检测器进行检测处理，经检测处理后的信号传输到光信号处理控制器，输出待测生物样品的数据，实现对待测物的定量测定