[发明专利]一种牛CSRP3基因单碱基突变的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和生物信息学领域，具体涉及基因单碱基突变的检测。

 

技术领域

本发明属于分子生物学和生物信息学领域，具体涉及基因单碱基突变的检测。

背景技术

目前，在家畜的遗传育种中，应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加家畜生产性能先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测牛经济性状密切相关的遗传标记；其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。

    SNP的检测方法有很多种，大多数方法以聚合酶链式反应为主要基础，利用碱基差异造成的DNA片段的各种差异来进行SNP检测和分析，如下所述：（1）单链构象多态性。实验证明300 bp以下的DNA片段中的单碱基突变，单链构象多态性检测方法检出率几乎100%，但300bp以上的片段检出率则不高，甚至还会出现漏检的情况；此外，其操作繁琐，需要特殊仪器；所用试剂包含有硝酸银和甲醛，易对人体健康造成危害；PCR产物电泳之前需进行特殊处理；电泳温度高低和凝胶浓度大小等均可影响其灵敏度的高低；实验重复效果不好。（2）创造酶切位点PCR法。其关键环节在于错配引物的设计，引物只能固定在突变位点的邻近序列设计。创造酶切位点PCR法稳定性高，结果准确，但是由于人为地引入了错配碱基，与正常引物相比，其扩增难度很高，扩增效率大大降低，将会直接影响到酶切的结果。(3)综上所述，以上方法均不是一种检测SNPs的理想的遗传标记方法。限制性片段长度多态性，此检测方法结合PCR产物直接测序法，检测单碱基突变的效率可以达到100%。此方法的关键是使用PCR将编码区域的序列在不同个体当中进行扩增，扩增的产物进行测序，测序结果与原来序列进行比对分析，以准确确定碱基突变的位置。PCR-RFLP具有快速，准确，方法简便，重复性高，成本低廉的优点，大量样本的分析可以用此种方法。

CSRP家族成员在肌肉生长发育过程中均起重要作用。研究表明CSRP3基因（又叫肌肉特异性LIM蛋白（muscle LIM protein，MLP）仅在肌中表达，且其表达与肌分化过程相一致，是一个肌发生的正调节因子(Arber et al., 1994）。另有研究表明，CSRP3基因编码产物MLP可以通过一种物理的方式与肌肉组织基本的螺旋一环一螺旋(bHLH)转录因子发生作用，这种作用具有高度的特异性，即MLP不与非肌源性bHLH蛋白或成肌增强因子2发生作用(Kong et al., 1997 )。MLP可能以共激活因子的形式促进肌源性bHLH蛋白与特定DNA调控元件的结合(Kong et al., 1997 )。由此，我们推测该基因可能对牛肌肉生长发育产生影响，值得深入研究。但是到目前为止，有关牛CSRP3基因的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛CSRP3基因单碱基突变的检测方法，该检测方法操作简单易行，成本低，时间短，重复性高，检测结果准确，极容易判型，便于推广应用。

为了实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现，该方法包括以下步骤：

（1）根据牛CSRP3基因在基因组序列中的位置，设计一对基因特异性引物；

所述的一对基因特异性引物如下：

上游引物CSRP3-GSP-F：  5'- CACAGGTCAGGAATCAAAG -3'  19bp；

下游引物CSRP3-GSP-R：  5'- GCAAAGGTCAAACAATAGG -3'  19bp。

（2）以包含牛CSRP3基因的DNA序列为模板进行PCR扩增；

所述PCR反应体系为15 μL，其中包括2×Reaction Mix 7.5 μL，ddH₂O 6.1 μL，上游引物CSRP3-GSP-F 0.3 μL，下游引物CSRP3-GSP-R 0.3 μL，Golden DNA polymerase 0.3 μL，含CSRP3基因序列的DNA模板0.5 μL。

以上各成分混匀后，进行分装，每管总体积15 μL。放入PTC-200 PCR扩增仪进行PCR反应，PCR程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，共计36个循环，72℃充分延伸10 min，最后16℃保存待用。