[发明专利]检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品中病原菌的快速检测方法，特别是一种以HisJ为靶基因的环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法及试剂盒，属于食品检测生物技术领域，适用于食品中沙门菌属的检测。

技术背景

沙门菌是最常见的食源性疾病病原菌，不仅能导致动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙门菌引起的中毒病例占首位或第二位。沙门菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是必需检测的项目，有重要社会、经济的意义。传统的沙门菌检测常用分离培养和血清学方法，确诊检验结果至少需5～7天，检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低等缺陷。因此，快速、准确、简便的沙门菌检测方法将是发展的方向。建立一种能快速检测沙门菌的检测方法具有重要的意义。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是建立于链替换自动循环反应基础之上。模板上的六个位点在恒温条件下被四条基础引物所识别并扩增，这赋予了此技术高度的特异性。与其他方法相比，环介导等温扩增只需要一个可以保持60-65℃恒温的简单加热装置如水浴锅。而且，环介导等温扩增反应在合成大量DNA的同时伴有大量的白色硫酸镁副产物，所以结果的判定只需肉眼简单观察浊度或通过加入DNA染料SYBR GreenI后观察颜色变化。HisJ基因被报道可以成功检测沙门菌分离株并被证明是一个可靠的靶基因(G.G.Stone，R.D.Oberst，M.P.Hays，S.McVey，and M.M.Chengappa，″Detection of Salmonella serovars from clinicalsamples by enrichment broth cultivation-PCR procedure，″Journal ofClinical Microbiology，vol.32，no.7，pp.1742-1749，1994；C.Gentry-Weeks，H.J.Hutcheson，L.M.Kim，D.Bolte，J.Traub-Dargatz，P.Morley，B.Powers，and M.Jessen，″Identification of twophylogenetically related organisms from feces by PCR for detection ofSalmonella spp，″Journal of Clinical Microbiology，vol.40，no.4，pp.1487-1492，2002)。

发明内容

本发明的目的是提供一种环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法，该方法能够快速、准确、高灵敏地检测食品中的沙门菌。

本发明通过以沙门菌种属特异性基因HisJ为靶基因，设计了一组四条引物特异性扩增HisJ基因以达到检测沙门菌的目的。为了使检测具有好的灵敏度与特异性，我们使用了BPW(蛋白胨水)进行预增菌，使用了孔雀绿培养基进行选择性增菌。获得了高特异性高灵敏度的结果。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法，采用GenBank登录号为CP001363.1的沙门菌HisJ基因序列，设计一组四条引物SALFIP、SALBIP、SALF3和SALB3C，以常规水煮裂解法提取的鼠伤寒沙门菌基因组DNA为模板进行环介导等温扩增，其步骤如下：

A、所述的引物序列为：

SALFIP：ttgcctttcagcgacgcgacttttctgattcccgtctggtggt；(SEQ ID NO.1)

SALBIP：tgctacaggggacgacgcagttttacgatctcaatccctttcgg；(SEQ ID NO.2)

SALF3：aggaaatcgcgtttaccgac；(SEQ ID NO.3)

SALB3C：gttgtcctgcccctggta.(SEQ ID NO.4)

B、所述的水煮裂解法步骤为：取细菌悬液1ml 8,000×g离心5分钟，沉淀使用PBS悬浮并洗涤；接着再用8,000×g离心获取沉淀并使用100μl超纯水重悬细菌；使用煮沸法裂解细菌，即细菌悬浮液在100℃煮沸10min，12,000×g离心3分钟，吸取上清作为模板；