[发明专利]胰蛋白酶亲和层析纯化人重组SPINK6蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白的纯化方法，具体涉及人重组SPINK6蛋白的亲和层析纯化方法。

背景技术

研究显示，目前临床实践所采用的抗肿瘤药物对肿瘤的治疗效果较差，特别是在肿瘤的复发和转移方面缺少有效的手段。市场迫切需要新型的治疗肿瘤的药物。

现有文献：(Martin C.Wapenaar，Alienke J.Monsuur et al；Immunogenetics，2007，59：349-357)中详细的报道了人源基因序列SPINK6基因序列，因其所编码的SPINK6蛋白带有一个Kazal domain，将其归为丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型的SERPIN家族。SPINK6蛋白的抗肿瘤活性已在有关细小病毒抗肿瘤作用研究中被发现，也已经申请发明专利(专利申请号：PCT/CN2009/074410)。该研究实验结果表明：当SPINK6基因在癌细胞株中过量表达时，使得癌细胞株失去了在软琼脂上形成克隆、在裸鼠体内成瘤能力，用基因工程的方法表达得到的重组SPINK6蛋白也可以有效抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤。专利申请号：PCT/CN2009/074410中构建了一种含有SPINK6基因的大肠杆菌和酵母菌的基因工程菌，并成功表达了重组SPINK6蛋白。但是所述研究方法中没有明确详细的阐明纯化方法，其实际的纯化过程中存在纯化效率低、回收率差、纯度只能达到80％左右，尚不能满足药用的纯度要求。因此寻找一种专一性好、产品纯度高、样品吸附量大的重组SPINK6蛋白的纯化工艺是目前十分迫切需要解决的难题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的上述缺陷提供一种胰蛋白酶亲和层析纯化人重组SPINK6蛋白的方法。

本发明的目的通过如下技术方案施行：

通过计算机结构模拟，发现人重组SPINK6蛋白模拟空间结构与丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶的活性区域能够很好的结合，从而抑制胰蛋白酶的活性(人重组SPINK6蛋白在摩尔比1∶1的条件下可完全抑制胰蛋白酶的活性)，本发明此基础上提供一种可靠的纯化方法，利用上述的高效的特异性结合显著提高SPINK6蛋白的纯化效果。

具体而言，本发明的胰蛋白酶亲和层析纯化人重组SPINK6蛋白的方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)制备亲和层析介质

参考GE公司出版的CNBr活化的Sepharose4B的使用说明书，进行亲和层析介质的制备。具体步骤如下：将亲和介质用pH2.0-3.0的HCl溶液进行溶胀、清洗，HCl溶液的用量为亲和介质的50-100倍体积量，然后用亲和介质的10-20倍的体积量的偶联液进行清洗，使亲和层析介质的pH达到8.0-10.0；

所用的偶联液为含有0.2-0.6M NaCl的NaHCO₃溶液(pH8.0-10.0)；

将胰蛋白酶以重量比1∶200-400溶解在偶联液中，然后与上步用偶联液清洗过的亲和介质混合，在室温条件振荡0.5-2小时，或于4℃条件下放置12-36小时，使胰蛋白酶与亲和介质偶联充分；然后用偶联液清洗制得的亲和层析介质，偶联液用量为制得的亲和层析介质体积的5-20倍；再用亲和介质体积1-5倍的0.1-0.5M的Gly缓冲液(pH 8.0)或1-2M乙醇胺溶液浸泡放置2-4小时，用于封闭亲和层析介质中未被结合的活性位点；

胰蛋白酶与亲和层析介质的重量比为1∶20-150；

所说的亲和层析介质选自交联琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、丙烯酰胺聚合物、聚醚砜或脱乙酰壳多糖中的一种或一种以上；

(2)人重组SPINK6蛋白用亲和层析介质进行纯化

用0.01-0.1mol/L pH7.0-9.0含0.05-0.15mol/L NaCl缓冲液A平衡装有亲和层析介质的层析柱；

将人重组SPINK6蛋白样品以10-75cm/h的流速上样至预平衡好的层析柱；

所说的单位cm/h为流速单位，即缓冲液每小时通过介质材料的高度。然后用0.01-0.1mol/L pH7.0-9.0含0.05-0.15mol/L NaCl的缓冲液A清洗上样后的亲和层析柱；

再用0.1-0.5mol/L pH 2.5-4.5的缓冲液B以10-55cm/h的流速将人重组SPINK6蛋白从层析柱上洗脱并收集洗脱峰；缓冲液B的用量为层析柱体积的3-10倍；洗脱液收集在装有0.5-2mol/L pH7.0-9.0的缓冲液A中；