[发明专利]重组大熊猫IL-6免疫佐剂的制备方法无效
申请号: | 201310362610.1 | 申请日: | 2013-08-16 |
公开(公告)号: | CN103409453A | 公开(公告)日: | 2013-11-27 |
发明(设计)人: | 李德生;朱玲;张和民;王承东;易悦;刘骁 | 申请(专利权)人: | 四川卧龙国家级自然保护区管理局;四川农业大学 |
主分类号: | C12N15/70 | 分类号: | C12N15/70;A61K39/175;A61K39/39;A61P31/14 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 623000*** | 国省代码: | 四川;51 |
权利要求书: | 查看更多 | 说明书: | 查看更多 |
摘要: | 本发明公开了一种重组大熊猫IL-6免疫佐剂的制备方法,包括以下步骤,A1大熊猫IL-6全基因克隆;A11大熊猫外周血淋巴细胞体外培养;A12总RNA提取;A13cDNA的合成;A14引物的设计与合成;A15目的基因的PCR扩增;A16目的基因PCR产物的TA克隆;A17重组质粒的初步鉴定;A2大熊猫白介素6的原核表达、多克隆抗体的制备;犬瘟热素有“毁灭性传染病”之称,已成为威胁大熊猫种群数量和生命安全的首要烈性传染病,严重影响了大熊猫的健康发展。本发明重组大熊猫IL-6免疫佐剂能显著增强犬瘟热疫苗免疫效果,对犬瘟热的防治具有重要意义。 | ||
搜索关键词: | 重组 大熊猫 il 免疫佐剂 制备 方法 | ||
【主权项】:
1.一种重组大熊猫IL-6免疫佐剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤A1大熊猫IL-6全基因克隆;A11大熊猫外周血淋巴细胞体外培养;无菌条件下采取健康大熊猫抗凝血2ml,置于EDTA-Na2真空管中,然后往里加入等量D-Hanks液稀释;缓慢加入4ml淋巴细胞分离液于稀释后的大熊猫外周血中,2000r/min离心20min。小心将白细胞移于另一试管,加等量RPMI1640液,2000r/min离心15min,去上清,沉淀物再加入4mlRPM11640液,洗涤2次,去上清;沉淀淋巴细胞用含10μg/mL ConA、10%小牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640液悬浮,取10μL细胞悬液计数,将细胞悬液稀释至5×106个/mL,分装于细胞培养瓶中,CO2培养箱中37℃培养24h;A12总RNA提取;A13cDNA的合成;A14引物的设计与合成;根据GenBank中已报道的大熊猫IL-6cDNA序列,运用引物设计软件Oligo6.0分别设计两对扩增IL-6全基因的引物,具体序列如下表所示:
A15目的基因的PCR扩增;以大熊猫基因组cDNA为模板,IL-6P1/P2为引物进行PCR扩增,反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性40s,60℃退火40s,72℃复性50s,该步骤进行30个循环;72℃延伸10min;于10℃保存;A1.6目的基因PCR产物的TA克隆;A161目的片段的回收A162目的片段与克隆载体连接将上步回收的产物与pMD18-T Simple Vector进行连接,16℃连接过夜;A163DH5α感受态细胞的制备;A164连接产物的转化;A17重组质粒的初步鉴定;A171重组质粒的小量提取;A172重组质粒双酶切鉴定;A173核苷酸序列的测定;将鉴定后的阳性重组质粒菌种保存液送宝生物公司测序;A2大熊猫白介素6的原核表达、多克隆抗体的制备;A21引物设计与合成;根据大熊猫IL-6基因测序结果以及信号肽分析结果,运用0ligo7.0设计引物:IL-6P1/P2,扩增编码IL-6成熟肽的cDNA碱基序列,引物见下表:
A22目的片段的PCR扩增;以重组质粒pMD18-T-IL6作为模板,加入特异性引物,进行PCR扩增;反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性40s,60℃退火40s,72℃复性50s,该步骤进行30个循环;72℃延伸10min;于10℃保存;A23目的基因的TA克隆A231IL-6的TA克隆将上步回收的产物与pMD18-T Simple Vector进行连接,16℃连接过夜;将上述TA连接液转化克隆菌DH5α,活化培养后将转化菌涂布含Amp(50mg/L)的LB固体培养基,置于37℃培养箱中,正置吸附0.5h,然后倒置培养12~24h;A24重组质粒的初步鉴定;A25原核表达载体的构建;A26重组表达菌株的培养及表达;A27原核表达条件的优化;A28重组表达蛋白的可溶性检测。
下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于四川卧龙国家级自然保护区管理局;四川农业大学,未经四川卧龙国家级自然保护区管理局;四川农业大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服】
本文链接:http://www.vipzhuanli.com/patent/201310362610.1/,转载请声明来源钻瓜专利网。