[发明专利]重组大熊猫IL-6免疫佐剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及，尤其涉及的是一种重组大熊猫IL-6(gpIL-6)免疫佐剂的制备方法。 

背景技术

大熊猫被誉为中国的“国宝”，是世界级珍稀野生动物，然而它却濒临灭绝，除了人为原因对大熊猫栖息地的破坏以外，疾病死亡成为当前大熊猫种群濒危的关键原因之一。在大熊猫所患的40多种疾病中，犬瘟热IL-6是威胁大熊猫种群数量和生命安全的首要烈性传染病。疫苗免疫目前是预防控制CDV的主要措施，但当前使用的疫苗并不十分理想，存在免疫效率低与安全性差两大难题。因此，在安全剂量疫苗接种下提高大熊猫机体的免疫力，成为当今疫苗开发研究的焦点。细胞因子是由免疫效应细胞和其他相关细胞产生，具有多种生物学活性。在免疫应答的产生和调节中具有重要作用。 

对于IL-6(白细胞介素6)的研究，最早可追溯到1980年，Weissenbach J等人发现成纤维细胞经Poly I-C刺激后能产生一种抑制病毒复制的细胞因子，当时称其为干扰素β2(Inteferonβ2，IFNβ2)。后经实验证实，干扰素β2与随后克隆得到的一系列生长因子，如B细胞分化因子(BCDF-2)，细胞毒T细胞分化因子(CDF)，肝细胞刺激因子(HSF)等，均是分子量为21～30kD的同种蛋白，因此为了避免名称使用的混乱，统一称之IL-6。IL-6是迄今发现的功能最为广泛的细胞因子之一。 

IL-6的来源十分广泛，机体的许多淋巴和非淋巴细胞均可表达IL-6，如T细胞、B细胞、单核-巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、上皮细胞、造血干细胞等，其中以巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞为主。其中血液IL-6主要来源于活化的单核细胞，局部组织IL-6由成纤维细胞与局部巨噬细胞产生，T细胞、B细胞、骨髓基质细胞等都能在不同条件下产生IL-6。另外，细胞因子(IL-1、IL-2)、促分裂原(LPS、PHA)、微生 物(某些细菌、病毒)和防线菌酮均能刺激或增加IL-6产生。 

人和小鼠的IL-6基因分别定位于染色体7p15-21和517.0cM，都有5个外显子和4个内含子。人IL-6前体为212个氨基酸残基，包括一段含28个氨基酸残基的信号肽，在分泌到胞外时信号肽被切割。成熟的IL-6含184个氨基酸残基，其1-28位氨基酸残基区无重要功能，主要跟蛋白的正确折叠有关；97-104位氨基酸残基区主要作用是维持蛋白结构完整；29-34位氨基酸残基区与180-184位氨基酸残基区紧密靠近，构成hIL-6的活性位点，在与受体结合、发挥生物功能过程中起关键作用。转录后修饰包括N糖基化、O糖基化和磷酸化，位于45aa，51aa，74aa，84aa的4个半胱氨酸形成两对二硫键，这对维持hIL-6的构象至关重要，N端28个氨基酸残基虽不直接与IL-6生物学活性有关，但对整个IL-6分子的组成起稳定作用。同时，研究表明，IL-6翻译后能被糖基化修饰或丝氨酸磷酸化，在原核表达中磷酸化与否不影响其生物学活性。对hlL-6的二级结构进行预测，发现IL-6由4个反向平行排列的α螺旋，2个长的和1个短的襻结构组成。X射线晶体衍射技术研究表明，IL-6和粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)具有共同的结构特征，并且在氨基酸序列上有高度的同源性。IL-6是一种糖蛋白，分子量由于在不同组织与个体间蛋白糖基化，磷酸化差异很大在19-28KDa之间。 

IL-6受体(IL-6R)分布细胞表面，并且分布数量有一些差别，从几百到上万个不等。IL-6受体在整个IL-6信号传导过程中起到重要的作用，IL-6只有与细胞膜上的受体结合后才能催发一系列级联反应，最终产生生物学效应。 

IL-6R为异源二聚体，由80KD的α链和130KD的β链(gp130)组成，α链cDNA全长约5.0kb，cDNA编码的蛋白为468个氨基酸，其中含有19个氨基酸残基的疏水信号肽，成熟的IL-6Rα链由以下三部分组成：339个氨基酸组成的胞外区，28个氨基酸组成的跨膜区和胞浆内82个氨基酸组成的功能区，胞膜外区含一个Ig样区(C2，约100个氨基酸)、2个III型纤维结合蛋白结构(各含100个氨基酸)及1个细胞因子受体的同源区所组成，后者含4个保守的Cys和一个WSXWS结构。gp130只有在糖基化后才能由胞浆内移到细胞表面，成为成熟的gp130，从而发挥生物学功能。成熟的gp130由三部分组成：597个氨基酸残基组成的膜外区、22氨基酸残基组成的跨膜区和277个氨基酸残基 组成的胞浆区。