[发明专利]一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法

摘要

本发明公开了一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法，包括环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的表达、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的纯化和环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备三个步骤；该方法采用Q柱对环丁烷嘧啶二聚体光修复酶进行分离，介质价格便宜，而且分离去除谷胱甘肽-S-转移酶的效果更好，更适于环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的产业化生产；本发明还将环丁烷嘧啶二聚体光修复酶制备为脂质体，使环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体能穿透细胞膜或者皮肤的屏障进入细胞，大大提高DNA损伤的修复效果。

主权项

一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的表达：从生物体中克隆到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶基因，将该基因构建到原核表达载体p GEX4T‑1中，再转化至大肠杆菌表达菌株E.coliBL21感受态细胞，得到菌液；在3～50ml含氨苄青霉素的LB培养基中加入LB培养基体积1～5％的菌液，37℃培养至OD600为0.6～0.8；再加入IPTG至终浓度为0.1～0.8mol/L，23～28℃诱导表达3～4h，在10000～12000个重力加速度条件下离心沉淀菌体，收集菌体，将菌体进行超声波破碎，破碎后的菌体液于10000～12000个重力加速度条件下离心去除菌体碎片，收集离心分离出的上清液，得到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶粗品；其中，超声波破碎的条件为：在200～400W的功率下，工作时间1～5s，间歇时间2‑5s，超声破碎20‑40min；b、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的纯化：将步骤a制得的环丁烷嘧啶二聚体光修复酶粗品以100～150ml/h的流速加入到谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱内，用5～10倍柱床体积的洗脱液A以200～400ml/h的流速进行淋洗，再以5～10倍柱床体积的洗脱液A和洗脱液B进行梯度洗脱，得到融合环丁烷嘧啶二聚体光修复酶；再按照1‑5U/mg蛋白质的用量，将凝血酶加入到融合环丁烷嘧啶二聚体光修复酶中，37℃酶解1～3h，切除谷胱甘肽‑S‑转移酶，得到酶切水解液；将酶切水解液以100～150ml/h的流速加入到Q柱中，用5～10倍柱床体积的洗脱液C以200～400ml/h的流速进行淋洗，再以5～10倍柱床体积的洗脱液C和洗脱液D进行梯度洗脱，得到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶；再将环丁烷嘧啶二聚体光修复酶进行脱盐柱脱盐处理，得到高纯度的环丁烷嘧啶二聚体光修复酶；其中，洗脱液A由50mM Tris/HCl和0.15MNaCl组成；洗脱液B由50mM Tris/HCl和10mMGSH组成；洗脱液C由10mM PB和0.15MNaCl组成；洗脱液D由10mM PB和1MNaCl组成；c、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备：称取50～100mg卵磷脂和20～50mg胆固醇，溶解于7.5～15ml乙醚中，加入0.1～0.5mg步骤b制得的高纯度环丁烷嘧啶二聚体光修复酶，再进行超声乳化，形成油包水，再进行蒸馏去除低沸点有机相，得到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体混悬液；再继续蒸发，直至白色悬液形成；将白色悬液以15000‑20000r/min离心30～40min，收集沉淀，冷冻保存，制得环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体。