[发明专利]一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA光修复酶制备领域，特别涉及一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法。

背景技术

环丁烷嘧啶二聚体光修复酶(cuclobutane pyrimidine dimmer photolyase，CPDase)是生物体利用光修复DNA损伤的主要工具。CPDase广泛分布在各种物种之中，是一种分子量在55-65kD间的单体蛋白，人体内尚未发现CPDase。目前在全球范围内，随着环境破坏与紫外线到达地面的剂量与强度的增加，皮肤病尤其是皮肤癌的发病率逐年上升，原因是太阳光中的紫外线会对生物体内的大分子造成伤害，使DNA产生环丁烷嘧啶二聚体(cuclobutane pyrimidine dimmer，CPD)等光产物。CPD损伤在人体中很难被NER途径等DNA损伤修复系统修复，这势必会使常常暴露于日光下的人群中出现CPD光产物的积累，该损伤的积累将会影响DNA的复制与转录，造成免疫抑制及红斑的产生，长期大量的积累会造成DNA的突变，进而造成癌变，而CPDase可有效清除紫外线照射细胞形成的CPD光产物，在防止紫外线损伤方面具有良好的效果。

目前，关于CPDase的制备方法国内外有相关专利和文献进行报道。国外已有文献报道不同来源CPDase的制备方法，包括基因克隆、蛋白质表达、纯化制备，这些CPDase纯化制备方法，主要采用传统的蛋白质纯化方法，即利用该蛋白质的溶解度、等电点、带电荷数、疏水性等理化特征进行分步纯化。美国《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.1984，259，6028-6032)报道，在制备大肠杆菌的CPDase时，采用基因克隆方法，将大肠杆菌CPDase基因构建到重组质粒，并使该重组质粒能在表达菌株中过量表达；收集、破碎表达后的菌体，离心收集的可溶上清液用硫酸铵沉淀，随后依次用苯基-琼脂糖柱层析、羟基磷灰石柱层析、二乙氨乙基-琼脂糖柱层析、DNA-纤维素柱层析和苯基-琼脂糖柱层析进行分步纯化。据美国《突变研究》(Mutation Research，1996，33，97-104)报道，在纯化果蝇CPDase时，构建一种CPDase基因重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌后，在表达菌株中过量表达，菌液经破碎、离心后，取可溶性上清液经硫酸铵沉淀蛋白质，随后经过蓝色-琼脂糖柱层析和DNA-纤维素柱层析进行两步亲和层析纯化蛋白质；但蓝色-琼脂糖和DNA-纤维素柱基质价格非常昂贵，在分离过程中也会存在一些非特异性吸附蛋白质的影响。因此，上述的纯化方法虽然能得到很纯的样品，但其纯化步骤繁杂，纯化周期长，因纯化过程中要多次更换层析柱，使样品处理过程复杂、蛋白质回收率低，使用的原理昂贵，不适合规模化批量制备蛋白质。最为重要的是，制备的CPDase不能穿透细胞膜或者皮肤的屏障进入细胞，从而导致DNA损伤修复效果不明显。

另外，特异性高的亲和层析方法是蛋白质制备的重要手段，发明专利200310106550.3中描述CPDase的亲和制备，包括扩增CPDase基因，构建到带有组氨酸-标签的载体质粒中；过量表达CPDase，离心收集菌液，高压破碎菌体，将离心分离出的上清液加入已结合镍离子并用含0.005-0.05mol/l咪唑的缓冲液平衡过的镍离子亲和层析柱内，用含0.005-0.05mol/l咪唑的缓冲液洗去不能结合或非特异性结合的杂蛋白，再用含0.5-1.0mol/l咪唑的缓冲液或者镍离子螯合剂洗脱，收集洗脱样品，透析，冷冻干燥，即得到CPDase。这种方法制备的CPDase含有外源组氨酸标签，这种标签可能会对CPDase的正常结构和功能造成影响，并对后续的应用带来潜在的安全隐患。国外在采用特异性高的亲和层析方法纯化另一种光修复酶时，对引入的外源标签进行去除。据美国《生物化学杂志》(J.Bio.Chem1997，272，32591-32598)报道，在纯化非洲爪蛙属(6-4)光修复酶时，是将基因重组构建到一个含谷胱甘肽-S-转移酶基因的重组质粒中，在表达菌株中过量表达，其蛋白质表达的产物为羧基端带有谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白质，通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析柱一步纯化得到很纯的融合蛋白质，然后用凝血酶切除谷胱甘肽-S-转移酶，最后利用DNA亲和柱纯化。这种方法利用的DNA亲和柱价格昂贵，而且条件不容易控制，不利于该蛋白质规模化生产。这些方法制备的CPDase同样不能穿透细胞膜或者皮肤的屏障进入细胞，从而导致DNA损伤修复效果不明显。

发明内容