[发明专利]一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法

权利要求书

1.一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法，其特征在于：按照下述步骤进行：

步骤一、实验器材及培养基准备

实验器材包括培养基瓶A、驯化瓶B和废液瓶C，将培养基瓶A和驯化瓶B之间、驯化瓶B与废液瓶C之间分别利用硅胶管相连通并借助于蠕动泵导流，驯化瓶B置于磁力搅拌水浴锅内、瓶内放置磁力转子；向培养基瓶A内倒入初始驯化培养基，所述初始驯化培养基的配方如下所述：酵母膏10g/L，麦芽提取物6g/L，葡萄糖50g/L，海盐50g/L，121℃灭菌20min；将25-35mL初始驯化培养基转移至驯化瓶B；

步骤二、第一轮驯化

取海洋芽孢杆菌野生菌株接种于ISP2种子培养基，所述ISP2种子培养基的配方如下所述：酵母膏2g/L，麦芽提取物2g/L，葡萄糖2g/L，海盐30g/L，121℃灭菌20min；200rpm、37℃培养至对数生长期，取1mL种子菌液接种至驯化瓶B中，于100rpm、37℃培养，当驯化瓶B中菌液OD₆₀₀达到0.8-1.2后，将驯化瓶B中菌液排至废液瓶C并留1mL作为下次驯化的种子液，从培养基瓶A导入25-35mL初始驯化培养基进行下一次驯化，直至用完培养基瓶A中培养基即完成第一轮驯化，取5mL菌液-80℃保存；

步骤三、迭代驯化

在完成上一轮驯化后，按10g/L梯度提高驯化培养基中海盐浓度并以上一轮经活化后的菌株作为种子细胞进行下一轮驯化，以此类推直至菌株无法在N g/L海盐渗透压胁迫条件下生长，终止驯化过程；

步骤四、优良突变菌株富集

将(N-10)g/L海盐渗透压胁迫驯化菌液重新在(N-10)g/L海盐渗透压胁迫条件下驯化一轮，避免菌株发生回复突变；再将菌液接种于正常ISP2发酵培养基传代20代，所述ISP2发酵培养基的配方如下所述：酵母膏10g/L，麦芽提取物6g/L，葡萄糖50g/L，海盐30g/L，121℃灭菌20min；排除因胁迫条件下基因差异而形成的假阳性菌株；之后取100mL细胞光密度为0.9×10^-5菌液涂布含(N-10)g/L海盐的ISP2发酵固体培养基，所述ISP2发酵固体培养基的配方如下所述：酵母膏10g/L，麦芽提取物6g/L，葡萄糖50g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min；37℃培养即可根据菌落形态获得高比例的优良突变菌株。