[发明专利]蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供一种蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒及其检测方法，含有蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因的扩增引物组，通过提取待测组织或血液总RNA，采用不同引物进行RT‑PCR扩增，再根据扩增产物大小检测蓝舌病毒及病毒血清型。本试剂盒提供扩增2种常见致病性血清型蓝舌病毒VP2基因的特异性扩增引物及其鉴定方法，有利于实现蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型的快速、准确的检测和鉴定。

技术领域

本发明涉及蓝舌病毒检测技术领域，具体涉及一种蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

蓝舌病毒（Bluetongue virus）属于呼肠孤病毒科、环状病毒属，是一种以库蠓为主要传播媒介感染包括牛、绵羊、山羊、反刍动物等发生蓝舌病（Bluetongue，BT）的病原体。蓝舌病可引起发热、极度呼气困难、口腔溃疡、皮肤和黏膜出血性病灶和重度出血性腹泻等不同临床症状，同时还会引起怀孕的反刍动物流产或产下先天感染和畸形后代，感染动物的平均病死率高达30%。自19世纪在南非发现首例感染蓝舌病的细毛羊后，由于其具有非接触传染性，可以在一些国家或地区传播、流行，同时造成反刍动物的大批死亡，带来巨大的经济损失，对畜牧业的发展构成了严重的威胁，因而引起了世界卫生组织的高度重视，WHO也将该传染病列为动物A类传染病。

蓝舌病毒存在多个不同的血清型，迄今为止全世界已发现27个血清型，而我国已鉴定出其中12个血清型的蓝舌病毒，分别为BTV-1、2、3、4、5、7、9、12、15、16、21以及23型，其中BTV-1型和BTV-16型在自然感染发病的绵羊体内分离获得，是主要的致病血清型。由于蓝舌病毒具有多种血清型，各血清型之间不存在交叉免疫，且具有变异较快，传播迅速等特点。因此早期的检测和诊断，是有效预防和限制该病毒流行的关键。

目前，蓝舌病毒的检测和鉴定需要在库蠓细胞、反刍动物组织细胞或者鸡胚中培养接种，从中分离扩增病毒，再通过血清学方法检测。但此类方法存在步骤繁琐、耗时长、成本高等缺陷，同时血清学检测灵敏性和特异性稍差，容易出现交叉反应，导致出现假阳性结果。近年来，随着分子生物学的发展，分子检测技术也有了进一步的提升，分子技术也普遍应用于病毒检测和诊断。

BTV基因大小约为19kb，由10分子双链RNA（dsRNA）组成，可编码12种不同的蛋白，包括7种结构蛋白VP1-VP7和5种非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS3a和NS4。其中VP2是病毒的主要特异型抗原和血凝素蛋白，可与受体结合、参与血凝，引导宿主特异性免疫，参与病毒毒力和细胞吸附作用，同时决定着BTV的血清型。不同血清型病毒之间VP2氨基酸序列差异在22.7%到72.9之间，研究表明VP2基因可用于血清型的检测。VP2由基因组片段L2编码，长度约为3000bp，本发明中提供一种检测蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因片段特异引物及其检测方法，有利于实现蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型的快速、准确的检测和诊断，缩短检测时间，对蓝舌病毒的早期检测、诊断、预防和限制该病毒的流行具有重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型的试剂盒和检测方法。通过利用蓝舌病毒1型和16型特异性引物PCR扩增其VP2基因片段，比对PCR产物条带大小，实现两种蓝舌病毒血清型的快速、准确检测。

为实现上述目标，所采用的技术方案如下：

一种蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒，所述试剂盒含有蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因特异性扩增引物，引物序列及产物大小如下：

a、蓝舌病毒1型VP2基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ACAGGCACAGTCCACTTACG3’；下游引物：5’ CATCTCGCGTGCAATCTTGG 3’；扩增片段长度为：700 bp；

b、蓝舌病毒16型VP2基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ACTGACGGAGCCAGAGGAT3’；下游引物：5’ TGACGTGGTATCCGCTTTCC 3’；扩增片段长度为：367 bp；