[发明专利]一种检测微生物肥料固氮效果的方法

说明书

本发明公开了一种检测微生物肥料固氮效果的方法，通过测定相同天然固氮菌量的固氮酶活性，用以判别各种含固氮菌的生物有机肥、固氮菌肥和微生物肥料的固氮效果。该方法的建立对促进功能生物有机肥、固氮菌肥和微生物肥料的健康发展，充分发挥固氮菌在替代化肥中的作用，为土壤生态改良、节能减排和绿色食品生产意义重大，适用范围广，经济和社会效益显著。

技术领域

本发明涉及肥料领域，特别涉及一种检测微生物肥料固氮效果的方法。

背景技术

微生物肥料中固氮微生物主要有固氮菌属、氮单孢菌属、拜耶林克氏菌属和德克斯氏菌属等细菌，杆状、卵圆形或球形，革兰氏染色阴性。这些固氮细菌具严格好氧性，能固定空气中的氮素，以分子态氮为氮素营养，将其还原为NH₃。固氮菌中的固氮酶除能将分子氮还原为氨外，还能催化一些具有N—N、N＝O、C≡N以及C≡C键化合物的还原，如将乙炔(C₂H₂)还原为甲烷(CH₄)等。

含固氮细菌的功能微生物肥料、生物有机肥、固氮菌肥的质量指标应包括固氮菌的含量和固氮效果。目前我国微生物肥料、生物有机肥和菌肥的质量指标中仅规定了所含菌体的种类和数量，如丰田宝生物有机肥中的有效活菌数≥0.2亿/g芽孢杆菌，其中含固氮芽孢杆菌0.1亿/g，其他为解磷菌、解钾菌和拮抗菌。虽然将芽孢杆菌定为质量指标，因不同芽孢杆菌在功能上差异很大，尤其固氮功能又是体现微生物肥料效果的核心指标，所以不同产品的应用效果往往差异很大。但国标中对其产品中固氮菌的数量、固氮效果和其他功能却没有附带要求，使含优质高效的固氮菌肥在现代农业和节能减排中的作用不能充分发挥。为促进功能生物有机肥、固氮菌肥和微生物肥料的健康发展，充分发挥固氮菌在替代化肥中的作用，为土壤生态改良、节能减排和绿色食品生产做出更大贡献，急需建立功能微生物肥料、生物有机肥、固氮菌肥固氮效果的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于创造一种检测微生物肥料固氮效果的方法，可准确评价功能生物有机肥、固氮菌肥和微生物肥料的固氮效果。

基于上述目的，本发明提供的一种检测微生物肥料固氮效果的方法，测定方法为：称取生物有机肥(或固氮菌肥、微生物肥料)100g，放于250ml的具塞三角瓶中，加入150ml无菌水浸泡4h，用漏斗过滤，将过滤后的清液用冷冻离心机离心，取沉淀(菌体)放于-80℃超低温冰箱中保存。以液体发酵的天然固氮菌解淀粉芽孢杆菌作对照，取发酵液10克，经冷冻离心机离心，取沉淀。

将对照和从肥料中提取的菌株分别接种到装有改良型半固体培养基的输液瓶中，反应体系中固氮细菌的浓度为0.01亿/mL，用透气滤菌封口膜封口，28℃培养72小时，用高纯氮气分别冲洗15s、30s和60s，以比较不同微氧状态下的酶活性。准确充入10ml高纯乙炔气体培养8小时，取气体样品60ul，立即加入2ml SDS中止反应。用气相色谱仪测定气体样品中的乙烯产量。测定条件为：活性Al₂O₃填充柱(3mm×2m)，氢焰检测器，柱温70℃，H₂压力60kPa，N₂压力70kPa，空气压力50kPa，检测器温度150℃，进样口温度150℃。乙炔和乙烯保留时间分别为3.142min和0.792min，氧气的保留时间为0.337min。数据采集和输出使用气相色谱仪配套的处理机系统。将已经中止反应的培养物100℃下加热5min，使半固体培养物液化，测定培养物中菌体蛋白含量。每个处理重复3次。固氮酶活性按毫克菌体蛋白每小时形成的乙烯量表示。