[发明专利]甜瓜U6基因及其应用

说明书

本发明提供一种甜瓜U6基因及其应用，本发明首次从甜瓜中克隆了U6基因全长序列，该基因与拟南芥、水稻、番茄中的U6基因高度同源，且在甜瓜根、茎、叶、花、果实、种子等不同组织中组成性表达，可初步确定为用于miRNA相对定量分析的内参基因。经试验证实甜瓜U6基因及其引物用于甜瓜miRNA的相对定量表达分析，具有准确性及稳定性的特点，为甜瓜基因定量表达分析提供新的选择。

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，涉及到甜瓜U6基因及其应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是一种世界广泛栽培的葫芦科作物，具有重要的经济价值。在对甜瓜基因表达定量分析时，为了克服非生物变异的影响，确保结果的准确性，选择表达稳定的基因作为内参进行数据的标准化最为关键。故，对甜瓜中能在不同组织中稳定表达的内参基因的开发，依然是本领域所面临的问题。

MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类非常重要的非蛋白编码小RNA，其长度一般为21-24个核苷酸，主要通过对靶标mRNA剪切或抑制其翻译过程在转录后水平调控基因表达。从2002年植物中miRNAs被发现以来，miRNAs的挖掘、表达和功能研究一直是一个研究热点。目前植物中已经发现数百种miRNAs，在植物组织器官的生长发育调控，逆境应答及激素信号调节等方面发挥重要作用。

研究miRNA的功能，首先应该对其时空表达特异性进行分析。目前用于miRNA表达分析的方法主要有高通量测序、基因芯片和实时荧光定量法。由于高通量测序和基因芯片法成本很高，不适于少量miRNA的表达分析。而基于SYBR Green染料的荧光定量PCR有着操作相对简单，成本较低，灵敏度高的优势，逐渐成为miRNA时空表达特异性分析的常用方法。而在相对定量中，内参基因的选择尤为重要。由于miRNA序列长度的特殊性，限制了传统的内参基因如β-actin等的应用。因此，有必要开发新的用于miRNA定量表达研究的内参基因。

U基因编码一种细胞核小RNA(small nuclear RNA,snRNA)，其长度一般为100-215个核苷酸，由于其编码的snRNA序列富含U，故命名为U基因。植物中主要包含7个U基因，命名为U1-U7，除U6由RNA聚合酶III催化转录以外，其他snRNA均由聚合酶II催化转录而来。由于U6编码的snRNA在不同组织中高表达，含量比较丰富，且表达稳定不受环境影响而变化，逐渐成为研究miRNA表达的内参基因。

但是目前在甜瓜中U6基因序列尚未报道，也没有相关引物的开发与应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，在甜瓜中克隆到U6基因全长序列，并初步确定该基因是用于miRNA相对定量分析的内参基因。

本发明采用的技术方案如下：本发明甜瓜U6基因，其snRNA的核心序列为：

GTCCCTTCGGGGACATCCGATAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCACAAATCGAGAAATGGTCCAAATTTTTTTTT(SEQ ID NO.1)。

基于甜瓜U6snRNA核心序列进行引物设计，获得的实时荧光定量PCR引物序列如下：

FP:GACATCCGATAAAATTGGAAC(SEQ ID NO.2)

RP:TTTGTGCGTGTCATCCTTGCGC(SEQ ID NO.3)

本发明人通过对甜瓜根、茎、叶、花、果实中的U6基因进行扩增发现该引物熔解曲线均出现单峰，特异性较好，且没有引物二聚体出现。同时，扩增曲线表明甜瓜不同组织中U6基因的CT值均在20左右，稳定性较好。

因此，进一步，本发明提供所述甜瓜U6作为内参基因在甜瓜miRNA的相对定量表达分析中的应用。