[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法

说明书

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法。本发明采用在陆川猪基因组的CD163基因的外显子7上设计两条gRNA，分别构建至pX458和Px458R载体上，使CD163基因发生DNA片段的精确删除而破坏外显子7所编码的SRCR5半个结构域，从而获得抗PRRSV感染的CD163基因编辑猪。本发明的方法通过双荧光筛选能够更加有效地破坏CD163的SRCR5结构域。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说，涉及一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状为主要特征的高度传染性疾病。CD163是一种位于细胞膜上的富含半胱氨酸(SRCR)结构域的PRRSV细胞受体，在PRRSV感染后病毒的脱壳与核酸释放过程中发挥重要的作用。

CD163共含有9个SRCR结构域，其中SRCR5在病毒感染过程中发挥主要的作用，有研究表明，SRCR5的缺失或破坏能抑制PRRSV的感染。同时有体外实验证明，SRCR5主要由CD163基因的外显子7负责编码。该发现为构建抗PRRSV的CD163基因编辑动物提供了依据，即通过基因编辑技术结合体细胞核移植的方法，制备出SRCR5被破坏的抗PRRSV的CD163基因编辑动物。

Cas9和gRNA是CRISPR/Cas9系统的基本成分，gRNA用于特异位点识别，Cas9用于切割靶位点DNA。与传统的基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统的构建更加简便、快速、廉价。研究发现，当gRNA的靶位点位于同一条染色体上时，利用Cas9和多条gRNA共转细胞，可以产生两条gRNA靶位点之间DNA片段的删除，DNA片段删除能更有效地敲除目的基因。

“陆川猪”短、宽、肥、圆。背腰宽广凹下，腹大常拖地、毛色呈一致性黑白花。历史悠久，品质优良，因原产与广西东南部的陆川县而得名，现主要分布于玉林、钦州、梧州等地。是中国八大地方优良猪种之一，具有繁殖力高、母性好、抗逆性强、肉嫩味鲜、体型紧凑、遗传力稳定等优点。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效敲除目的基因的方法，其利用CRISPR/Cas9编辑猪CD163基因。

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法，其在陆川猪基因组的CD163基因的外显子7上设计两条gRNA，分别构建至pX458和pX458R载体上，使CD163基因实现DNA片段的精确删除而破坏外显子7所编码的SRCR5结构域，得到抗PRRSV感染的CD163基因编辑猪；其中，所述CD163基因的外显子7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的方法，用于打靶所述CD163基因的外显子7的所述两条gRNA分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子。

根据本发明的方法，通过CRISPR/Cas9进行基因编辑对应的精确删除区域为如SEQID NO.1所示的核苷酸序列自5’末端第24-147位的核苷酸。

根据本发明的方法，通过CRISPR/Cas9进行基因编辑的步骤如下：

步骤1：将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA-10构建到能表达Cas9蛋白和报告基因EGFP的pX458载体上，得到Px458-gRNA-10；将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的gRNA-134构建到能表达Cas9蛋白和报告基因DsRed的pX458R载体上，得到Px458R-gRNA-134；将所述pX458-gRNA-10和所述pX458R-gRNA-134共转染猪的离体胎儿肾细胞，得到CD163基因编辑细胞群；