[发明专利]基于POCKITMicro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂及应用，本发明还涉及针对禽流感病毒H7亚型的检测试剂盒及检测系统。

背景技术

禽流感(Avian Influenza)是禽流行性感冒的简称，它是由禽流感病毒引起的一种禽类急性传染病，被国际兽疫局定为甲类传染病。通常禽流感只在禽类之间感染和传播，但有时也能感染人类，自1997年香港首次发现人感染禽流感以来，全球多地均报告了人禽流感病例，病死率约60％。虽然禽流感被发现已逾百年，但至今人类并未掌握特异性的预防和治疗方法，仅能以消毒、隔离、大量宰杀禽畜的方法防止其蔓延。因此，禽流感目前已成为一个重大的公共安全问题，在给禽类和人类健康带来严重威胁的同时，也给社会造成了巨大的经济损失。

禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科的甲型流感病毒，多为球形，直径80～120nm，有囊膜，病毒表面有10～12nm的密集钉状物或纤突覆盖，病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。禽流感病毒基因组由8个负链的单链RNA片段组成，共编码10个病毒蛋白。依据其套膜上的血凝素(H)/和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。在禽类中高致病性禽流感病毒为H5、H7亚型，典型的鸡禽流感病毒为H7N7型，人感染禽流感病毒主要为H5N1、H9N2、H7N7型。

H7亚型是1955年被发现并确定的禽流感病毒亚型，作为一种高致病性禽流感病毒，近年来，H7亚型病毒的暴发已导致全球超过七千万家禽的死亡，疫情波及欧洲、亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲，由于该亚型病毒多为暴发型且破坏力巨大，因此引发了全球的广泛关注。虽然目前针对H7亚型的基础研究已取得了一定的进展，例如已经测定获得了其HA基因的全部序列以及血凝素基因的部分序列，但我们的研究还有很大的局限，对病毒进化、致病机制、流行规律等仍不甚了解，因此，只有进一步加强在人群和动物中对该亚型禽流感病毒的监测，同时致力于基础研究和相关疫苗及药物的研发，才能使我们从容地应对未来可能出现的禽流感疫情。为了实现上述目的，研究开发针对禽流感病毒H7亚型的检测试剂，并建立操作简便、快速、敏感性好、特异性强的检测方法和检测系统是很有必要的，将其推广应用于禽流感的早期筛查会对疫情的预防和控制产生积极的影响。

发明内容

针对上述问题，本发明人研究开发了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂，并在该检测试剂的基础上建立了禽流感病毒H7亚型的检测试剂盒及检测系统。本发明检测试剂盒及检测系统操作简单、检测速度快、敏感性好、特异性强、方便易携带且检测成本较低。

利用本发明检测试剂盒及检测系统可在实验室、医院、畜牧场、饲养场、活禽市场等各种场所即时的对禽流感病毒H7亚型进行检测，并能够准确、快速的获得检测结果。

第一方面，本发明提供了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂，所述检测试剂中包含检测禽流感病毒H7亚型的特异性引物和探针，其中，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述探针的核苷酸序列的5'端连接有荧光报告基团FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和MGB修饰基团。

进一步地，本发明涉及上述检测试剂在制备禽流感病毒H7亚型检测试剂盒中的应用。

尤其是，本发明还涉及上述检测试剂在制备禽流感病毒H7N7或H7N9亚型检测试剂盒中的应用。

此外，本发明还涉及上述检测试剂在制备H7亚型禽流感诊断或治疗药物中的应用。

第二方面，本发明提供了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含标准品和荧光定量PCR反应试剂；所述荧光定量PCR反应试剂包含dNTPs、Taq酶、缓冲液、特异性引物和探针；其中，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述探针的核苷酸序列的5'端连接有荧光报告基团FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和MGB修饰基团。

进一步地，上述检测试剂盒中还包含阳性对照品和/或阴性对照品。

优选地，上述检测试剂盒中的标准品为包含禽流感病毒H7亚型HA基因或该基因片段的重组质粒。