[发明专利]一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法

说明书

本发明涉及一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β‑葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）固体发酵产β‑葡萄糖苷酶；（2）制备粗酶液；（3）非变性凝胶电泳；（4）酶活染色；（5）提取；（6）纯化。在本发明的技术方案中，使用的菌株是土样中筛选得到厚垣镰孢霉，该菌株经过固体发酵产两种β‑葡萄糖苷酶，分子量分别为93kDa和52kDa，在生物乙醇、造纸等方面具有潜在的工业应用价值；本技术方案分离纯化步骤均在4℃下进行，操作步骤少、生产工艺简单、可以实现工业化生产且生产成本低，纯化效率高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法。

背景技术

β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌、约氏黄杆菌等，真核生物来源的有清酒酵母、黄孢原毛平革菌等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、 猪肝和猪小肠等。β-葡萄糖苷酶由于其来源不同，它们的相对分子量也可能不同，而且它们的结构和组成也有很大差异。β-葡萄糖苷酶的相对分子量范围一般在40～250kDa之间，而其结构可能是由单亚基、双亚基或多亚基构成。此外，有的菌株本身含有胞内和胞外β-葡萄糖苷酶，因此，有时来源于同一菌株的β-葡萄糖苷酶是两种不同分子量酶的混和物，甚至是多种不同分子量酶的混合物。不同来源的β-葡萄糖苷酶在氨基酸序列、分子量、比活力、等电点、最适反应pH值、pH值稳定性范围、最适反应温度和热稳定性范围上均有很大差别，因此不同来源的β-葡萄糖苷酶可在不同领域具有潜在的工业应用价值。

目前，β-葡萄糖苷酶的制备通常采用的方法是：先用微生物发酵方法得到含β-葡萄糖苷酶的发酵液，该过程中采用霉菌作为目标菌，繁殖速度慢，发酵时间长；再对含β-葡萄糖苷酶的发酵液进行分离纯化，分离纯化过程沿用蛋白质纯化的经典步骤，如硫酸盐沉淀、柱层析等方法。因步骤复杂且成本较高，因此大多数仅限于实验室研制开发阶段，国内外工业化生产β-葡萄糖苷酶制剂的企业相对较少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种分离纯化步骤简单、纯化成本较低、纯化得到的β-葡萄糖苷酶可以实现工业化生产并在生物乙醇、造纸等方面具有潜在的工业应用价值的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法，包括以下步骤：

（1）固体发酵产β-葡萄糖苷酶：将筛选得到的厚垣镰孢霉HML278通过生理盐水制成孢子液，并将孢子液转入以甘蔗渣和麸皮为碳源的固体培养基中固态发酵，产含β-葡萄糖苷酶的培养物；

（2）制备粗酶液：将步骤（1）制得的培养物加入200-250 mL无菌ddH₂O，30℃-50℃恒温水浴1-3h浸提，四层纱布过滤，5000-7000 r/min离心5-15 min得到粗酶液，收集上清酶液2℃-6℃保存备用；

（3）非变性凝胶电泳：在2℃-6℃条件下，用步骤（2）中收集到的上清酶液在分离胶质量分数为5%-10%、浓缩胶质量分数为2%-8%、恒定电压为30V-100V的条件下进行非变性凝胶电泳22h-25h，得到含β-葡萄糖苷酶的凝胶；

（4）β-葡萄糖苷酶活性染色：在2℃-6℃条件下，剪切步骤（3）中含β-葡萄糖苷酶的凝胶得到凝胶胶条，对该凝胶胶条活性染色，活性染色液为质量分数为0.1%的七叶苷和质量分数为0.03%的三氯化铁，在25℃-35℃下反应3 min-10 min，凝胶胶条中含有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白催化底物产生黄黑色产物，以该染色凝胶胶条为导向，可确定步骤（3）中电泳凝胶上含有β-葡萄糖苷酶的活性蛋白条带的位置；