[发明专利]一种无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法

说明书

本发明提供了一种无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法，该方法包括抗原的制备、家兔的筛选、免疫接种、血清的收获及鉴定。本发明首先通过无乳链球菌灭活疫苗对家兔进行基础免疫，然后使用灭活疫苗和灭活抗原进行加强免疫制备无乳链球菌型特异性抗血清。以本发明制备的无乳链球菌型特异性抗血清，相对于使用无佐剂无乳链球菌抗原，具有抗体效价高的优点；相对于使用弗氏佐剂免疫，具有价格低，安全性更高的优点；相对于使用活菌攻毒进行加强免疫，具有简便、安全性高的优点，同时使用家兔制备阳性血清，成本较低，具有突出的规模化应用前景。

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法。

背景技术

无乳链球菌(S.agalactiae)是引起奶牛乳房炎的主要病原体之一，具有高传染性，常存在于奶牛的皮肤、乳头及乳房内，通过挤乳人员的手或挤乳机械以及蝇类的机械携带而传播，附着在乳腺管壁并将其破坏，引起慢性乳房炎，潜伏期可达数周或数月，不易发现。同时，无乳链球菌还是造成孕妇产褥期脓毒血症和新生儿脑膜炎的一个重要原因。它寄生在产妇生殖道，可致婴儿感染的发生。也可引起产后感染、菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染及骨髓炎。

无乳链球菌以荚膜分型，共有10个血清型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型)，各个血清型之间无交叉保护力。血清型的鉴定对于无乳链球菌性奶牛乳房炎流行病学调查和疫苗的研制至关重要。但目前国内并没有商品化的无乳链球菌型特异性抗血清供应，虽然国外有B组链球菌的阳性参考血清，但多分离自人，且价格昂贵、供货周期期长，远远不能满足需要。

荚膜分型血清的制备的关键在于保证荚膜的完整性，否则抗体滴度会显著不同。因此，菌液培养的方法也尤为重要。传统制备分型血清的方法为采用无佐剂法耳静脉免疫家兔制备，其产生的抗体低，不能满足规模化生产的要求；近年来，有报道采用弗氏佐剂免疫家兔制备分型血清，但其价格较高，副反应大，易造成兔子背部出现破溃等副反应，且使用活菌攻毒的方法制备阳性血清，易造成免疫动物发病死亡，且短期多次免疫注射，需要不断制备新鲜的菌液，费时费力。

因此，有必要建立一种安全、实用、产生效价高的制备无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法，以解决目前国内缺少分型血清的问题。目前尚未见有采用无乳链球菌灭活疫苗制备型特异性抗血清的报道。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种添加新型佐剂制备无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法，以解决现有技术中缺乏相关方法的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是无乳链球菌型特异性抗血清的制备抗体效价较低和需要活菌多次注射的问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法，包括以下步骤：

1)制备无乳链球菌菌液；

2)取步骤1)所得的菌液分别制备无乳链球菌灭活疫苗和无乳链球菌灭活抗原；

3)取步骤2)所述疫苗和抗原对家兔进行免疫接种；

4)从步骤3)免疫接种后的家兔体内收获血清。

作为优选，步骤3)所述的家兔是2.0～4.0kg清洁级，日本大耳白兔或新西兰大白兔。

作为优选，步骤3)所述的免疫接种包括以下步骤：

A)基础免疫：取步骤2)制备的无乳链球菌灭活疫苗，每次以2～4ml的剂量皮下多点注射2次，2次的时间间隔为10～15d；

B)灭活疫苗强化免疫：步骤A)完成7～10d后，取步骤2)制备的无乳链球菌灭活疫苗皮下和腿部肌肉多点注射2次，第1次剂量为4～6ml，第2次剂量为第1次剂量的1～2倍，2次的时间间隔为5～7d；