[发明专利]一种快速确诊猫白血病的检测方法及其试纸条的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于猫白血病的快速确诊的检测方法及其试纸条的制备，属于医学检验领域。

背景技术

猫白血病病毒(FeLv)世界性猫感染的常见原因，并伴随有较高的发病率和死亡率。猫白血病的常发病症有恶性淋巴肿瘤、骨髓性白血病以及变性性胸腺萎缩和非再生性贫血等，其中对猫最严重的是恶性淋巴肿瘤。猫白血病病毒(FeLv)的特征在于会引发猫的终生感染，早期并不会出现明显的症状，随之会出现持续性的病毒血症，后期治疗十分困难，最终会产生致命的结果。在发病早期准确确诊猫白血病并及时给予治疗，是治愈猫白血病的最佳选择。持续性感染的病猫成为了猫白血病病毒(FeLv)的直接传染源，其唾液、粪便、尿、乳汁、鼻腔分泌物均含有病毒，通过呼吸道、消化道传染到健康猫。将确诊的病猫隔离是控制猫白血病病毒(FeLv)的有效途径。因此，一种快速准确确诊猫白血病的检测方法是控制和治疗猫白血病的关键。

猫白血病早期症状不明显，仅仅根据临床症状很难确诊，要确诊猫白血病，有效的检测方法必不可少。目前，常用的检测法有：血常规检查、病理切片、酶联免疫吸附、免疫胶体金技术等方法检测病猫组织中的FeLV。其中血常规检查和病理切片检测检测时间较长，起不到快速诊断的效果。酶联免疫吸附的检测成本相对较高，并且在检测过程中影响因素较多，易出现假阳性结果，对于猫白血病的检测，酶联免疫吸附法准确度欠佳。同时，胶体金检测信号较弱、灵敏度低等限制了其应用。因此需要一种稳定的，易操作，耗时短、灵敏度高的检测方法用于猫白血病的确诊。

发明内容

基于此，本发明的目的在于一种易操作，耗时短、灵敏度高、定量检测猫白血病病毒的方法及其试纸的制备，实现猫白血病早期病毒的快速检测。此方法采用荧光定量侧向免疫层析原理检测猫全血，血浆，血清，唾液或眼泪中的猫白血病病毒(FeLv)。本发明所述的抗体标记的荧光微球可以是一种金属胶体颗粒、一种磁颗粒，包括但不仅限于乳胶纳米颗粒。此荧光微球标记的抗体，以荧光乳胶微球为例的制备方法，包括以下步骤：

(1)将定量的荧光乳胶微球溶液加到缓冲溶液中稀释，超声1.5min，得到荧光微球分散液。

(2)向步骤(1)中的荧光乳胶微球分散液中迅速滴入活化剂，快速置于涡旋振荡器上低速震荡1min后，固定在涡旋振荡器上，室温下震荡活化30min。

(3)活化结束后，将步骤(2)中的荧光乳胶微球分散液在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，用步骤(1)中的缓冲溶液清洗，再次以相同条件离心后，弃去上清液，用步骤(4)中缓冲溶液复溶重悬。

(4)取FeLv单克隆抗体，加入缓冲溶液稀释至0.06mg/mL。

(5)将步骤(3)中复溶的纳米颗粒分散液加入到步骤(4)中的抗体稀释液中，立刻在涡旋震荡器上震荡1.5min，随后超声1.5min，然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应1h。

(6)反应结束后，将步骤(5)中溶液超声1min，在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，加入封闭液，同样然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应1h。

(7)将步骤(6)中溶液离心后再次加入封闭液清洗，在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，可得到荧光微球标记的抗体。

步骤(1)的缓冲溶液是2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液，其pH为7.2。

步骤(2)中活化剂是EDC&NHS活化剂。

步骤(3)中复溶的缓冲溶液以及步骤(4)的缓冲溶液均是硼酸酸缓冲溶液，其pH值为7.8。

本发明还提供了一种基于上述方法制备的荧光微球标记的抗体的试纸条，其特征在于，试剂盒的结构如图1所示：在塑料底板(1)一端粘贴样品垫(2)，样品垫的一端紧密压接喷涂有荧光微球标记的猫白血病病毒抗体的结合垫(3)，结合垫(3)一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有检测线T1(5)和质控线C(6)，NC膜的另一端连接吸水垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡壳内形成试纸卡。包括以下组装步骤：

(1)抗体标记的荧光微球中加入重悬液，反复吹打，随后超声5min直至沉淀完全溶解。

(2)将步骤(1)中的抗体标记的荧光微球溶液用划膜喷金机喷涂于结合垫，随后在烘箱中37℃下烘干1h。

(3)将对照线和检测线要包被的抗体，分别用适宜的稀释液稀释后，用划膜喷金机将其分别喷涂于硝酸纤维素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(4)组装粘贴结合垫、样品垫，密封过夜，使之充分粘合。