[发明专利]普鲁兰合成酶、编码基因、载体及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种普鲁兰合成酶、编码基因、载体及在提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量中的应用。

(二)背景技术

出芽短梗霉是一种重要的工业微生物，能够分泌产生多种工业酶，例如淀粉酶，葡萄糖醛酸酶，木聚糖酶和多种胞外兰多糖，例如聚苹果酸，葡聚糖和普鲁兰多糖，其中产量最高的普鲁兰多糖具有良好的生物安全性，生物相容性和延展性，无色，无味，无接触刺激，可广泛应用于生物医药材料，食品包装，化妆品和农业环保领域，具有广泛的应用潜力。

出芽短梗霉是普鲁兰多糖的主要工业生产菌株，高产菌株的普鲁兰多糖生产能力能够达到80g/L发酵液。出芽短梗霉具有很强的胞外普鲁兰多糖合成能力，与其合成途径酶基因有密切关系。但是关于出芽短梗霉多糖的合成途径及其相关基因却始终未有准确阐明。根据已有的研究结果我们归纳出如下结论：在短梗霉细胞中UDPG是所有多糖合成的共同前体分子，UDPG经过不同的糖基转移酶和聚合酶催化，聚合成不同种类的多糖，例如普鲁兰多糖，然后多糖分子经过细胞膜的运输通道，被运输到细胞外。但是到底哪些酶参与了普鲁兰多糖的聚合途径却始终没有详细研究。到目前为止没有检索到任何分子水平的关于短梗霉来源的普鲁兰多糖合成途径相关酶和合成机制的研究成果。本发明首次从出芽短梗霉中克隆得到普鲁兰多糖合成的途径的关键酶-普鲁兰合成酶的编码基因，利用大肠杆菌系统重组表达蛋白，通过普鲁兰多糖体外合成实验，验证了该酶对于反应体系的普鲁兰多糖合成具有促进作用。本发明通过出芽短梗霉基因敲出实验，证明普鲁兰合成酶在普鲁兰多糖的生物合成是不可缺少的，该酶基因的缺失将导致短梗霉普鲁兰多糖合成能力的彻底丧失。本发明通过代谢工程技术，在短梗霉中过表达普鲁兰合成酶，显著提高了菌株普鲁兰多糖的合成产量。本发明提供的出芽短梗霉普鲁兰合成酶的研究成果，将有助于分子水平理解普鲁兰多糖的合成机制，开展短梗霉高产普鲁兰多糖的代谢工程研究具有重要参考价值。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种能够提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量的酶，即普鲁兰合成酶，同时提供了普鲁兰合成酶编码基因及大肠杆菌重组载体以及普鲁兰合成酶在提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种普鲁兰合成酶，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种所述普鲁兰合成酶编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，所述编码基因的cDNA序列为SEQ ID NO.3所示。

本发明涉及一种由所述普鲁兰合成酶编码基因构建的大肠杆菌重组载体。所述载体的构建是将SEQ ID NO.3所示cDNA序列连入pET28a载体的NdeI和XhoI酶切位点而获得。

本发明涉及一种所述普鲁兰合成酶的基因敲除载体pAPKO19pul。所述载体的构建是将SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示上下游同源臂序列融合于SEQ ID NO.6所示的潮霉素表达盒序列两端，组成的融合基因片段，克隆到pMD18-T而获得。

本发明涉及一种用于所述普鲁兰合成酶基因过表达载体，pAPE16pul。所述载体的构建是将SEQ ID NO.7所示18srDNA基因序列融合于SEQ ID NO.6所示的潮霉素表达盒序列5’端，再将SEQ ID NO.8所示18srDNA基因序列融合于SEQ ID NO.9所示的普鲁兰合成酶基因表达盒序列3’端，最后将两个融合基因片段，首尾相连后，克隆到pMD19-T而获得。