[发明专利]一种氢氯噻嗪半抗原和完全抗原及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氢氯噻嗪半抗原和完全抗原及其制备方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

氢氯噻嗪为利尿药、抗高血压药，其结构如化学式Ⅰ所示。主要适用于心原性水肿、肝原性水肿和肾性水肿：如肾病综合征、急性肾小球肾炎、慢性肾功能衰竭以及肾上腺皮质激素与雌激素过多引起的水肿；高血压；尿崩症。在降压类药物、保健食品中非法添加氢氯噻嗪，造成化学药品的用法用量无法控制，容易造成药物滥用带来的不良反应，甚至造成药害，国家明令禁止在中成药和保健食品中添加化学成分。患者在不知情的情况下服用，也会影响医生正确指导患者用药。

 

化学式Ⅰ

目前我国氢氯噻嗪片的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法（LC/MS）等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器方法是氢氯噻嗪检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。

本发明的氢氯噻嗪半抗原是在氢氯噻嗪的亚氨基一端接出活性羧基，得到单一特异性结构的氢氯噻嗪羧基衍生物，该衍生物为氢氯噻嗪半抗原，将氢氯噻嗪半抗原与载体蛋白偶联，形成氢氯噻嗪完全抗原。

发明内容

本发明的目的是针对现有的检测技术的空白，提供一种氢氯噻嗪半抗原和完全抗原的制备方法，使得制备高特异性的氢氯噻嗪单克隆抗体成为可能。

本发明的技术方案，一种氢氯噻嗪半抗原，结构简式如下：。

所述氢氯噻嗪半抗原制备的完全抗原，将氢氯噻嗪半抗原化合物与载体蛋白偶联后得到氢氯噻嗪完全抗原；

所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一种。

所述氢氯噻嗪半抗原的制备方法，步骤为：取氢氯噻嗪0.24mmol，溶解于20mL二甲基甲酰胺DMF中，加入碳酸钾0.48mmol，混匀，再加入6-溴已酸乙酯0.48mmol，60℃回流反应12h，再加入20mL超纯水和20mL乙酸乙酯，分离有机相；用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，得氢氯噻嗪半抗原。

氢氯噻嗪半抗原其合成路线的反应方程式为：

。

所述氢氯噻嗪完全抗原的制备方法，步骤为：

（1）氢氯噻嗪半抗原的活化：将氢氯噻嗪半抗原用DMF溶解，加入NHS、EDC，其中氢氯噻嗪半抗原︰NHS︰EDC的摩尔比为1︰1.5︰1.5，在4℃下搅拌反应6h，再在室温25℃下反应12h；

（2）载体蛋白的溶解：取载体蛋白，其中氢氯噻嗪半抗原︰载体蛋白的摩尔比为80︰1，用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的载体蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与DMF的比例为5︰1；

（3）氢氯噻嗪完全抗原的制备：将步骤（1）所得活化的氢氯噻嗪半抗原溶液慢速滴加到步骤（2）所得载体蛋白溶液中；室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到氢氯噻嗪完全抗原。

所述氢氯噻嗪完全抗原的另一种制备方法，步骤为：

（1）氢氯噻嗪半抗原的活化：将氢氯噻嗪半抗原用DMF溶解，0℃预冷30min，0℃下加入三正丁胺和氯甲酸异丁酯，其中氢氯噻嗪半抗原︰三正丁胺︰氯甲酸异丁酯的摩尔比为1︰2︰2，在0℃反应1h；

（2）载体蛋白的溶解：取载体蛋白，其中氢氯噻嗪半抗原︰载体蛋白的摩尔比80︰1，用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的载体蛋白浓度大于3mg/mL；

（3）氢氯噻嗪完全抗原的制备：在0℃条件下，将步骤（1）所得活化的氢氯噻嗪半抗原溶液在0℃条件下慢速滴加到步骤（2）所得载体蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到氢氯噻嗪完全抗原。

所述氢氯噻嗪完全抗原的应用，将氢氯噻嗪完全抗原免疫动物得到多克隆抗体和/或单克隆抗体，用于检测氢氯噻嗪。

本发明的有益效果：本发明是新型的氢氯噻嗪完全抗原合成方法，氢氯噻嗪完全抗原呈现出的特异性的氢氯噻嗪抗原决定簇，使得筛选出高特异性的氢氯噻嗪单克隆抗体成为可能。