[发明专利]一种琥珀酸的生物制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，公开了一种琥珀酸的生物制备方法，与传统的方法相比，具有产量高，生长周 期短，培养基简单。利用本发明生产的琥珀酸用于医药、生物工程、塑料、生物化工等行业。

背景技术

琥珀酸为四碳二元酸，可以用作食品的调味剂，磺胺、维生素等药物的合成原料，也可以用于油漆、染料的 合成，制作化工清洗剂以及用于合成可降解的生物塑料等，需求十分广泛。目前世界各国规定用于食品的琥珀 酸只能够使用发酵法制得的产品，严禁使用化工方法合成的产品。

传统的化工合成方法为从丁烷通过顺式丁烯二酐生产，而丁烷是通过石油裂解方法制造的。随着石油资源的 枯竭，其生产成本越来越高。

生物发酵法是以葡萄糖为原料，通过细菌的代谢在常温、常压下制备琥珀酸。这种方法较化工方法所获得的 琥珀酸的成本至少便宜20％以上。随着从生物质如秸秆、树叶、锯末等农林废弃物制造葡萄糖技术的发展，生 物发酵法制造琥珀酸的成本会进一步降低，其生产成本会更进一步降低。

美国能源部组织专家和学者对可以作为基础化工原料且能够从生物质原料中转化生产的化合物进行了遴选， 最后选定了12种具有战略性意义的化合物作为21世纪生物化工原料研究和开发的重点，琥珀酸名列其中。所 选定的化合物可以利用现有的以化石能源为基础的化工设施进行进一步加工，即不需要进行大的固定资产投资， 就可以进行生产。

2015年全世界塑料的产量预计将达到2亿9千7百万吨，全世界约8％的石油及天然气等化工能源用于 塑料的生产。我国塑料的产量占全世界产量的23.5％。随着化工能源的枯竭及伴随的价格增长，和化工能源消 耗所导致的温室气体效应等一系列问题，使人们越来越重视利用可再生能源如生物质、陈化粮淀粉等来加工塑 料。这种以生物质为载体的塑料，可以在环境中降解不造成白色污染。在生物质的生产过程中均伴有二氧化碳 的利用，可以降低大气中二氧化碳的浓度，减少温室气体效应。

发明内容

发明的目的在于提供一种琥珀酸的生物制备方法，与传统的方法相比，具有产量高，生长周期短，培养基 简单的特点。利用本发明生产的琥珀酸用于医药、生物工程、塑料、生物化工等行业。

为了达到上述目的，对糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖通路进行了改造，使葡萄糖进入细菌后，绝大部分 转化为琥珀酸，并在这一过程中利用二氧化碳，使其骨架整合到琥珀酸，提高了产量。

为了达到上述目的，需要对代谢通路中的一些基因进行敲除，有些基因需要增加其表达量，而且由于一些 涉及细菌的主要代谢通路，需要分阶段进行调整。

本发明提供的方法构建的菌株具有产量高、生长周期短、培养基简单等特点，生产的琥珀酸可用于医药、 生物工程、环境保护、塑料、生物化工等行业。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况 下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中，所涉及到的百 分比(％)，若未特别指出，液体之间的百分比为体积百分比，固体之间的百分比为重量百分比，固体与液体之 间的百分比为重量体积比(10％即表示每100ml液体中含固体10g)。

以构建可以生产大肠杆菌的琥珀酸酸为例，说明本发明的具体实施方式。

一.磷酸烯醇式丙酮酸消耗和调控途径基因的敲除：

1.丙酮酸激酶基因的条件敲除敲除：

pykAUpGCCGAGCGGCCGCtttcggattaggctcttcagc

pykADntattatcgcgatctgttgctgg

pykAUp1ccagcaacagatcgcgataataTAGTCTAGAggatcAGATCTagtaagtacgttgccggatg

pykADn1GCCGAGCGGCCGCaaagttccgtgatcccattct

2.葡萄糖转运蛋白基因ptsI的敲除：

PtsIUpGCCGAGCGGCCGCccgcattgtttgccgatctcttca

PtsIDnaagcagagctttaccgaaagcgat