[发明专利]一种补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法

权利要求书

1.一种补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，包括以下步骤：

(1)菌悬液的制备及样品处理

①菌悬液制备

在琼脂固体培养基斜面上复苏菌种，接种至液体培养基中扩增培养得到菌液，按照比浊法确定菌液的工作浓度，用生理盐水将菌液稀释成工作浓度即得菌悬液；

②试剂准备

显色剂配制成质量体积分数为0.1％～3％的显色剂溶液，将显色剂溶液过滤除菌，于2～8℃避光保存；

③样品处理

补体为与免疫动物非同源的动物血清、阴性血清为免疫动物注射生理盐水的血清，阳性血清为市售的目标菌的诊断血清，补体稀释至5～10倍，阳性血清和阴性血清分别稀释至原倍～10倍，将稀释5～10倍的补体与菌悬液按体积比为1:1～1:2的比例混合后冰浴静置2～30分钟得到活化菌悬液；

(2)杀菌检测

①加样稀释

取待检血清加至无菌微孔板的样品孔中，用生理盐水进行倍倍稀释；阳性对照样品孔、阴性对照样品孔中分别加入稀释至原倍～10倍的阳性血清和稀释至原倍～10倍的阴性血清；补体空白对照孔和细菌活性对照孔分别加入液体培养基，每个对照重复三孔；

②杀菌反应

除细菌活性对照孔外，微孔板中的其余各孔均加入步骤(1)③所述的活化菌悬液，细菌活性对照孔中加入步骤(1)①所述的菌悬液，然后将微孔板于37℃条件孵育1～8小时，再在微孔板的每个孔中加入37℃预热的培养基，再孵育1～12小时；

(3)显色判定

①显色，在微孔板的每个孔中均加入步骤(1)②所配制的显色剂溶液后，于37℃孵育0.5～6小时显色；或将微孔板于2～8℃静置过夜，在微孔板的每个孔中均加入步骤(1)②所配制的显色剂溶液，于37℃孵育0.5～6小时显色；

②判定

显色或出现针尖状沉淀为阴性结果，即不具有杀菌活性，不显色或出现片状沉淀的为阳性结果，即具有杀菌活性；当阳性血清对照组为阳性结果，阴性血清对照组、补体空白对照组和细菌活性对照组均为阴性结果时，待检血清显色或出现针尖状沉淀为阴性结果，即不具有杀菌活性；待检血清不显色或出现片状沉淀为阳性结果，即具有杀菌活性。

2.根据权利要求1所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特征在于：步骤(1)①菌悬液制备所复苏的菌种为伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌属、大肠埃希菌属、溶血性弧菌属或痢疾志贺氏菌。

3.根据权利要求2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特征在于：

步骤(1)①菌悬液制备中菌种为伤寒沙门菌时，所述的琼脂固体培养基和液体培养基均为中国国家标准GB4789.4—2010中的缓冲蛋白胨水培养基，所述的工作浓度为10×10⁵～10×10⁸/ml；

步骤(1)②试剂准备中所述的显色剂为四氮唑紫或新四氮唑；

步骤(2)①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤(2)②杀菌反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1～4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入的阴性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔加入的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空白对照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB4789.4—2010中的缓冲蛋白胨水培养基；

步骤(2)②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20μl～40μl，细菌活性对照孔中加入的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37℃预热的培养基的用量为样品孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2.5～3倍，所述的37℃预热的培养基为中国国家标准GB4789.4—2010中的缓冲蛋白胨水培养基；

步骤(3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤(1)②所配制的显色剂溶液的量与样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。