[发明专利]一种齐口裂腹鱼cGnRH Ⅱ基因克隆的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种齐口裂腹鱼cGnRH II基因克隆的方法，属于基因克隆技术领域。 

背景技术

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)，又称促黄体素释放激素(1uteini-zing hormone-releasing hormone，LHRH)，是由下丘脑分泌的十肽激素，是动物生殖过程中最重要的激素之一。GnRH脉冲式释放刺激垂体促性腺激素(GTH)的合成和分泌从而调节性激素的分泌，是性腺轴系的原动力，对性腺还可能具有直接作用。GnRH已被证明是下丘脑一垂体一性腺轴(hypothalamus-pituitary-gonadalaxis，HPG)的关键信号分子。GnRH家族中最保守的是chicken GnRH II(chicken-II-type Gonadotropin-releasing hormone，cGnRH II)，它随同其他分子形式的GnRH共同存在于大多数脊椎动物中，存在于所有的有颌类包括人类中。 

近年来，随着PCR技术的快速兴起和成熟，cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)为简洁方便的基因克隆发展道路指出了新的方向。RACE是利用PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA末端的方法，又称为锚定或单边PCR，一般有两种RACE方法，分别用于扩增3′端或5′端。5′RACE比3′RACE更具有挑战性，其特异性较低，产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。最终质量取决于扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA5端结构的复杂度和丰度及产物的长度等因素。可利用巢式引物扩增(最多进行三轮巢式扩增)，增加逆转录保温温度和PCR退火温度，降低扩增反应中的镁离子浓度等方法增加5′RACE的特异性。SMART反转录酶法RACE技术比较而言是中最为成熟的。但是对于不同的试验对象仍然需要一定的改进。DTT是一种蛋白质保护剂，此外还有解开mRNA链5′端高级结构的作用。RACE技术的成功应用已经显示出它是一种高效简便的技术手段。它除了在获得全长cDNA序列方面的应用外，随着生物学各项技术的交叉利用，对RACE技术的改良和发展，伴随着优化条件下PCR扩增效率和忠实度的提高以及PCR产物克隆技术的进步，相信RACE技术在基因克隆以及RNA剪接、基因家族和基因表达变化等多项领域。 

目前，所采用的技术有：RT-PCR克隆：是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)以及分子克隆相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的基因片段，将合成的目的基因片段克隆到载体细胞基因 中，然后用质粒PCR产物测序。该技术缺点在于：克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病，即实验操作繁琐，周期较长、工作量繁重，且不易得到全长cDNA序列。另外，也有采用分段PCR克隆法：将目的基因分成几段来分别克隆，然后做亚克隆测序拼接。成本高，工作量大耗时，一个基因分成几段就需要做几次克隆，然后再做序列接拼。该技术缺点为：克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病，即实验操作繁琐，周期较长、工作量繁重，且不易得到全长cDNA序列。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效、方便的获取齐口裂腹鱼chicken GnRH II基因的全长序列的方法，填补了该基因在齐口裂腹鱼上的空白，为进一步研究齐口裂腹鱼的该基因奠定了基础。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。 

一种齐口裂腹鱼cGnRH II基因克隆的方法，具体包括以下步骤： 

(1)脑组织RNA的提取：总RNA提取采用TaKaRa试剂，具体步骤如下： 

(1a)从-80℃冰箱中取出冻存组织，取100mg左右，放入高温灭菌处理过的研钵中，加入液氮，磨成粉末； 

(1b)向1.5ml离心管于加入1ml预冷的Trizol裂解液，迅速把组织粉末放置于离心管中，剧烈振荡5min，使其充分溶解； 

(1c)4℃条件下12000rpm离心10min，然后吸取上清的Trizol裂解液至新的1.5ml离心管中，冰上放置5分钟； 

(1d)吸取0.2ml氯仿加入离心管中，激烈振荡15s，室温静置5min，4℃条件下13000rpm离心10min，将上层水相转移至新的EP管中； 

(1e)加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，冰上沉淀10分钟；