[发明专利]IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测试剂盒及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学诊断技术领域，具体地说，涉及一种IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测试剂盒及其用途。

背景技术

哺乳动物细胞中的IDH（异柠檬酸脱氢酶）家族包括3个成员：IDH1、IDH2和IDH3。IDH1存在于细胞质和过氧化物酶体中，IDH2与IDH3存在于线粒体中。这三种酶都催化异柠檬酸盐（isocitrate，ICT）氧化脱羧产生CO₂和α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）。这些反应需要二价离子（Mg²⁺或Mn²⁺）参与，并且需要辅助因子NADP⁺（IDH1和IDH2）或者NAD⁺（IDH3）作为电子受体，分别产生NADPH或者NADH。IDH1和IDH2是结构相似的同工异构酶，而IDH3与IDH1和IDH2不同，其酶结构是一个包括两个IDH3A亚基、一个IDH3B亚基和一个IDH3G亚基的异四倍体蛋白质。

    IDH1基因定位于2q33.3。IDH突变超过90%是IDH1突变，几乎都是发生在酶的底物结合位点之一的残基R132的精氨酸。大约90%为精氨酸被组氨酸替代（R132H），其他少见类型突变也都发生在R132残基，包括半胱氨酸（R132C；3.6%—4.6%）、丝氨酸（R132S；0.8%—2.5%）、甘氨酸（R132G；0.6%—3.8%）或亮氨酸（R132L；0.5%—4.3%）替代精氨酸。其中IDH1 R132C突变与星形细胞瘤密切相关。有研究者分析了Li-Fraumeni综合征家族（TP53种系突变）中星形细胞瘤患者的IDH1突变，发现所有肿瘤的IDH1突变都发生在R132C，表明已经携带TP53突变的前体细胞可以产生这个相对稀有的IDH突变。IDH1酶底物结合位点中还有另外两个保守的精氨酸残基（8100和8109），仅有一篇报道称在两例间变性少突胶质细胞瘤（WHO III级）和一例星形细胞瘤（WHO II级）中存在R100Q突变。

IDH2基因定位于15q26.1。所有IDH突变中IDH2突变仅占3%—5%，甚至更少。突变影响IDH2保守的精氨酸残基R172，导致精氨酸被赖氨酸（R172K）、甲硫氨酸（R172M）、甘氨酸（R172G）或色氨酸（R172W）所替代。另外，IDH2突变仅在没有IDH1突变的胶质瘤中被检出，且IDH2突变主要发生在少突胶质细胞瘤。

迄今为止，还没有任何IDH3与癌症相关的报道。

IDH1/IDH2基因突变发生在肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的IDH1/IDH2基因高度保持一致。一般认为，IDH1/IDH2基因状态不会因治疗而发生变化。IDH1/IDH2基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40%，胰腺癌为90%以上，肺癌约为15%。IDH1/IDH2基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13密码子（≥90%），这些突变破坏了IDH1/IDH2蛋白内在的GTPase活性，从而使得IDH1/IDH2蛋白处于持续活性状态。

带有IDH突变的弥漫性胶质瘤患者与带有野生型IDH的相比，具有较长的生存期。这一规律在WHO II—III级的星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和WHO IV级的胶质母细胞瘤中也相继被证实。IDH突变肿瘤发生于年轻患者，年龄是胶质瘤一个已知的预后因素。实验中发现，IDH1突变是患者总生存率最有力的单一预后因素，其后才是年龄、肿瘤类型和MGMT甲基化状态。预后改善的原因之一可能是突变IDH的生物学结果。突变IDH1 R132H可能阻碍稳定转染的胶质瘤细胞系的生长和转移。现在对于胶质母细胞瘤和WHO II—III级星形细胞瘤来说，IDH突变状态被认为是独立的正性预后因素。因此，在临床实践中检测是否存在IDH突变有重要临床意义。同时，在胶质瘤分类和分级诊断中应该考虑到IDH具体突变情况，以便临床进行分层治疗和判断预后。

以往胶质瘤诊断及其分级主要依赖组织病理学，但仅靠组织形态学，特别是立体定向取材小标本，组织缺乏典型病变，常常不能根据肿瘤的密度、异型性、血管增生、坏死等进行分级。当取材为肿瘤边缘，尤其低级别胶质瘤，或肿瘤治疗后判断是否存在复发情况，区分这些胶质细胞是肿瘤还是反应性增生显得十分困难。直接测序法检测基因突变则存在步骤繁琐、工序复杂、费时费力的不足。