[发明专利]用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类乳腺癌中的BRCA1表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

乳腺癌作为女性的常见肿瘤，已成为癌症死亡的第二大原因。其诊断主要建立在影像学检查基础上，缺乏实验室特异性诊断指标，给早期诊断带来困难，容易漏诊或误诊，而手术切除又是乳腺癌首选治疗方法，但是术后影响形态，美观不佳，对患者造成较大困扰，更有部分患者因此产生的心理阴影，严重影响她们的生活质量。目前多认为乳腺癌应采取多种方法结合的综合治疗，原发病灶的彻底清理是乳腺癌治疗的关键。另外早期诊断也显得尤为重要，早发现是争取其良好预后的关键。

乳腺癌1号基因(breast cancel susceptibility gene1，BRCA1)是世界上第一个被发现的家族性乳腺癌抑癌基因，定位于17号染色体长臂上，由包括22个编码外显子和2个非编码外显子。目前研究发现,DNA修复是铂类化疗耐药性产生的主要机制之一。临床运用表明铂类药物的疗效存在显著的个体差异，部分患者获益，部分患者耐药并出现毒副作用。大量临床研究已经证实：铂类药物的疗效与肿瘤组织中BRCA1基因mRNA表达水平密切相关，即BRCA1基因表达水平低的患者对铂类药物敏感，反之表达水平高的患者表现耐药。然而，抗微管类化疗药是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的。这类药物时常出现治疗有效率低和副作用大的问题，而且存在显著的个体差异。大量的临床研究显示，抗微管药物的疗效与肿瘤组织中BRCA1基因的mRNA表达水平密切相关，即BRCA1基因表达水平高的患者对抗微管类药物敏感，反之表达水平低的患者表现耐药。因而，BRCA1表达水平对于后期的用药有很重要的指导作用。

在实际应用中，用于检测BRCA1表达的方法主要为免疫组化，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使我们探索新的方法来检测BRCA1表达水平。

实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性,而且能对PCR进行实时在线检测,反应BRCA1在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间,还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法,双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本发明采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于BRCA1基因检测。

发明内容

鉴于现有技术中检测BRCA1的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测BRCA1基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒。

用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于：

检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、d NTP、Mg²⁺、检测用上下游引物BRCA1-F/BRCA1-R和探针BRCA1-Probe、参照用上下游引物Actin-F/Actin-R探针Actin-Probe；其中，

BRCA1-F：CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA

BRCA1-R：GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT

BRCA1-Probe：FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA

Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT

Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT

Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。

进一步地，检测用上下游引物和探针的比例优选为：BRCA1-F︰BRCA1-R︰BRCA1-Probe的摩尔比为2︰2︰1。

参照用上下游引物和探针的比例优选为：Actin-F︰Actin-R︰Actin-Probe的摩尔比为2︰2︰1。

所述阳性对照品为含有BRCA1基因组的溶液；所述阴性对照品为无BRCA1基因组的溶液。