[发明专利]一种鉴定落叶松枝条生根能力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中的鉴定落叶松无性繁殖枝条生根能力的特异引物序列及其利用该引物序列鉴定落叶松枝条生根能力的方法和应用。

背景技术

落叶松是具有重要经济和生态价值的树种类型，具有较高的抗旱能力。由于多分布处于寒冷和高山地带，从地底汲取充足的水分成为落叶松生长的必要条件，树木根系是控制树木与其周围环境进行能量和物质分配的关键器官之一，因此具备高的生根能力是提高植物抗旱能力的重要途径之一。

为了使落叶松亲本的优良性状保持稳定并扩大繁殖系数，满足生产对良种的需要，扦插繁殖已成为落叶松的主要繁殖方式之一。用于规模化无性繁殖的理想基因型应兼备速生和良好的生根能力。根据采穗园各母株插穗生根能力的研究和综合评价结果，伐除生根能力差的母株，可以大幅度提高采穗园插穗的生根能力，改善扦插苗根系发育状况。

然而，采用常规测定生根率等方法进行生根能力判定、筛选耗时、费力，同时易受外界环境因素的影响。随着分子生物学技术的发展，从DNA水平，借助分子标记技术对目标性状进行预判、早期筛选及鉴定成为可能。由于其不受环境因素影响，且不需要植株表现出性状就可对其进行筛查，大大缩短育种年限，同时可减少人力和物力的浪费，因此分子标记辅助技术在对不同基因型落叶松生根能力进行早期筛选、鉴定方面就有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的是克服现有的根据测定生根率等耗时、耗力筛选、鉴定落叶松生根能力的方法，提供一种快速、早期鉴定落叶松生根能力的引物序列和利用该引物鉴定落叶松扦插后生根能力强弱的一种方法和应用。 

本发明的技术方案概述如下：

一种用于鉴定落叶松枝条生根能力的特异性引物，其特征在于它由引物序列5’ CTGCTTAGGGGTGGCCTGTC 3’（ SEQ NO:1）和5’ CTGCTTAGGGAGAACCATGGATGTG  3’（ SEQ NO:2）组成。

本发明的另一个目的是提供一种包括特异性引物的PCR试剂盒，并利用该PCR试剂盒鉴定落叶松无性繁殖材料生根能力。该试剂盒由PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶组成，其成分如下：

PCR引物：SEQ NO.1 和SEQ NO.2各50μL （浓度为10 μM/L）；

10 mM dNTP               50μL；

10×酶特异性反应缓冲液   500μL；

5 U/μl 耐热DNA聚合酶   200μL；

阳性对照品               15μL，

阴性对照品                15μL；

ddH₂O                     10mL；DNA聚合酶为Taq聚合酶。

本发明更进一步公开了采用该试剂盒鉴定落叶松无性繁殖材料生根能力的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）提取落叶松基因组DNA；

（2）基因组DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；

（3）特异引物PCR扩增，在PCR扩增专用的离心管中加入： PCR缓冲溶液、dNTP、引物序列对5’CTGCTTAGGGGTGGCCTGTC3’和5’CTGCTTAGGGAGAACCATGGATGTG 3’、落叶松基因组DNA、Taq聚合酶、无菌水补至25μL，将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为：94℃变性2 min，后进入降式PCR：94℃ 30 s,65℃ 1 min,72℃ 1min10 s，的扩增循环，循环环数为10，每个循环温度降低1℃，随后94℃ 30 s,55℃ 1 min,72℃ 1min10 s ，共25个循环；最后在72℃延伸5 min，扩增完成；