[发明专利]一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于肿瘤细胞检测和核酸试剂制备领域，特指一种纳米核酸-银簇（DNA-AgNCs）的制备方法及其在用荧光光谱法快速检测细胞中HIF含量的运用。

背景技术：

最近几年，纳米银簇（AgNCs）因具有独特的物理学、电学和光学性质，在化学传感、生物传感、成像及诊断等方面的应用，引起了很多的关注。鉴于纳米银易聚集不稳定的特点，用模板来合成较稳定纳米银簇的方法得到了广泛研究，以树枝状大分子、小分子物质、多肽、蛋白质和DNA等为模板，成功的合成了在水中稳定的纳米银簇 (J. Sharma, R. C. Rocha, M. L, Phipps, H.C. Yeh, K. A. Balatsky, Dung M. Vu, A. P. Shreve, J. H. Werner, J. S. Martinez, A DNA-templated ?uorescent silver nanocluster with enhanced stability, Nanoscale, 2012, 4, 4107–4110)。先后有以聚甲基丙烯酸、植酸钠、双功能络合剂（翁建;崔强;丁家包，一种聚甲基丙烯酸微波合成荧光银纳米粒子的方法， 中国发明专利201010540810.8；杨海峰;王娜，具表面增强拉曼散射活性的菜花状纳米金-银合金的制备方法， 中国发明专利201010133185.5；吕荣文;邹伟;张淑芬，对含硝基的爆炸化合物高敏感检测的银纳米簇及其制备，中国发明专利201110194650.0，）等为模板合成不同尺寸和用途银纳米粒子。由于Ag⁺和Ag与DNA上的胞嘧啶有很高的亲和性，以多胞嘧啶核苷酸的DNA为模板可合成稳定、有优异的光谱和光物理性的银簇 。DNA不仅是生命体中重要的遗传物质，与蛋白质的翻译和酶的形成有中要关联，还是许多物质的目标分子，因此，基于DNA的纳米银簇（DNA-AgNCs）为探测各种疾病治疗和诊断中重要的分子提供强大平台（H. C. Yeh, J. Sharma, I. M. Shih, D. M. Vu, J. S. Martinez, J. H. Werner,  A fluorescence light-up Ag nanocluster probe that discriminates single-nucleotide variants by emission color, J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 11550?11558）。 缺氧诱导因子（HIF）是激活线粒体氧化磷酸化和无氧酵解的开关，通过诱导糖酵解酶和葡萄糖转运子基因的表达，激活和促进糖酵解过程。肿瘤细胞中HIF高表达因此，HIF成为肿瘤重要标志之一，探测肿瘤细胞HIF的变化对于肿瘤诊断和治疗具有重大意义。目前HIF-1的体外检测一般采用凝胶电泳的方法，此方法有检测灵敏度较低, 操作复杂，周期长等缺点。因此，开发简单快速，灵敏度高，特异性强，准确检测细胞内HIF的分析技术仍然是一个挑战。

发明内容：

本发明设计了一种新的脱氧核酸（DNA）序列：5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’，其特点为由合成纳米银簇序列（5’CCTCCTTCCTCC3’）和与HIF有相互作用的识别序列（5’CTACGTGCT3）组成的双功能DNA序列为5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’。其次以这种双功能DNA为模板，于柠檬酸钠缓冲溶液中，利用NaBH₄还原AgNO₃的方法，成功合成了具有荧光的核酸纳米银簇（DNA-AgNCs）。这种核酸纳米银簇（DNA-AgNCs）在激发波长为510 nm下能发射585 nm的荧光，DNA-AgNCs的荧光量子产率为34.4%（以罗丹明B为参照），纳米银簇的大小为~2 nm。 其585 nm的荧光能被DNA的互补序列(AGCACGTAG) 及HIF高表达的肿瘤细胞全蛋白淬灭，说明该核酸纳米银簇（DNA-AgNCs）是一种灵敏的荧光探针，可用于定性分析细胞全蛋白中HIF的含量，并可用于区分HIF高表达的肿瘤细胞和正常细胞。此荧光探针4℃环境中可保存大于4个月荧光未见明显变化。

一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法，按照下述步骤进行：