[发明专利]一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗遗传转化的方法

说明书

技术领域

 本发明属于植物生物技术领域，尤其是甘蔗愈伤组织遗传转化方法。 

背景技术

甘蔗是我国最为重要的糖料作物，2011/2012榨季，我国蔗糖产量为1151万吨，蔗糖产量占到全国食糖总产的91%，可见甘蔗产业在保障全国食糖供应体系中具有至关重要的地位。但是，甘蔗种植过程中经常出现病虫害频繁发生、季节性干旱以及低温冷害等问题，造成生产损失严重，蔗农和制糖企业收入受损，导致我国制糖产业国际竞争力下降。因此，生产上迫切需要提高品种的产量和抗逆境胁迫能力，培育高产、高糖、高抗和高经济收益的优良品种。 

甘蔗栽培种是由甘蔗属热带种、细茎野生种、印度种、中国种等多个物种间的种间杂交形成的复合体，染色体数量多，基因组结构复杂。甘蔗栽培种对光周期反应敏感，一般只能在低纬度地区才能开花，而且不同基因型的开花时间相差较大，一些重要种质材料经常由于花期不育等问题难以配置杂交组合。因此，甘蔗常规杂交育种难度大，周期长，选育一个品种往往需要10年左右的时间。而且，由于甘蔗基因组大且复杂，没有纯合体，无法针对某个单一性状进行定向回交，新选育的种质往往由于单一性状的缺陷无法推广应用。基因工程是定向、快速改良植物性状的方法，通过转基因技术在提高植物抗病虫以及干旱、寒害等逆境胁迫方面已经有了许多成功报道。由于甘蔗是营养繁殖，T₀代转基因植株就可以稳定目标基因性状，与水稻、玉米等其他作物相比，甘蔗转基因减少了外源基因自交、纯合的选育过程，更容易获得既保持供体植株原有主要目标性状，又对某个单一性状进行改良的效果。因此应用转基因技术定向改良甘蔗周期短，效果好，是甘蔗遗传改良的重要途径。 

目前甘蔗的遗传转化技术主要是采用基因枪法和农杆菌介导法。基因枪法虽然操作简单，但是外源基因插入拷贝数多，易产生嵌合体，遗传稳定性差。与基因枪转化方法相比，农杆菌介导转化方法外源基因插入的拷贝数低，对受体伤害小，设备简单。自1998年报道农杆菌介导甘蔗遗传转化成功以来，农杆菌介导法在甘蔗上的应用已有多个报道。但是，目前农杆菌介导甘蔗遗传转化上的应用仍存在一些不足，转化效率一般都在3%以下，转化成本高、时间长。农杆菌介导甘蔗遗传效率低的主要原因之一是在农杆菌菌株和甘蔗愈伤细胞侵染过程中工程菌株和愈伤细胞不能充分接触，另外在侵染后为了将共培养后的愈伤组织上携带的农杆菌去除干净，对愈伤组织要进行水洗、干燥等处理，处理过程中一方面损失了一部分转化成功的愈伤细胞，另外对愈伤细胞的生长也有伤害，导致后期获得转基因植株量减少。 

发明内容

本发明目的在于提供一种真空渗透辅助根癌农杆菌介导转化甘蔗的方法，其克服现有技术的不足，提高甘蔗农杆菌遗传转化效率。 

一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗心叶愈伤组织遗传转化的方法，包括以下步骤： 

（1）    甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖；

（2）    含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养；

（3）    真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织；

（4）    抗性材料的筛选与出苗；

（5）    抗性材料鉴定。

步骤（1）所述甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖方法是： 

（1．0） 取甘蔗茎尖生长点以上不大于6cm的幼嫩心叶作为外植体，无菌条件下，将消毒好的外植体切成0.5～2.5mm的圆盘片；

（1．1） 将步骤（1．0）的外植体接种于愈伤诱导培养基上，置于26～28℃的黑暗条件下培养，挑选生长状况良好的胚性愈伤组织继代一次；

（1．2） 挑步骤（1．1）的生长状况良好的继代后胚性愈伤组织转接入新的愈伤诱导培养基上，进行活化培养；

愈伤诱导培养基是：MS + 2-4 D （1～4）mg/L + 蔗糖30g/ L + 琼脂 （7～9）g/ L。

 步骤（2）所述含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养方法是： 

（2．0）挑取含有Bar基因的根癌农杆菌菌株EHA105的单菌落；

（2．1） 将步骤（2．0）的单菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的1ml YEP液体培养基中，在温度为26～28℃、震荡速度为200 rpm的条件下，培养3 ~ 4 小时；

（2．2） 取步骤（2．1）的菌液150 ~ 300μL，涂布于YEP固体培养基（含Rif 50 mg/L和Kan 50mg/L）上，在温度26～28℃下暗培养24～48小时，收集YEP固体培养基上的菌体；